单纯疱疹病毒实验室检测方法的研究进展

赖迪辉综述 朱 威 连 石审校

单纯疱疹病毒(HSV)感染是由 HSV侵犯皮肤黏膜,引起炎症、水疱、糜烂、溃疡性病变的一种疾病,根据抗原性不同,可将 HSV分为 HSV 1型和 HSV 2型,两者虽有约 50%的基因同源性,但 HSV1主要引起腰以上部位,如眼、口、唇的皮肤黏膜以及中枢神经系统的感染[1]。HSV 2主要引起生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染,并与女性外阴癌和宫颈癌的发生有关[2]。HSV2外生殖器感染是发病率仅次于人免疫缺陷病毒(HIV)感染的性传播疾病,已引起了医学界的高度重视[3,4]。近年来,由 HSV 1型引起的生殖器疱疹及 HSV亚临床感染或隐性感染有增多趋势,并且HSV两种亚型感染的预后和处理方法不同,复发频率亦有差异[5],HSV1感染引发的生殖器疱疹症状较轻,易于治疗。而 HSV2感染发作时的症状一般是生殖器周围出现疼痛性皮肤疱疹损害,并容易复发。当需要与其他生殖器溃疡性疾病,如非感染性或感染性龟头炎、宫颈炎、梅毒等进行鉴别诊断时,实验室证据非常重要。因此对 HSV感染进行诊断和分型具有重要的临床意义和流行病学意义。本文对HSV的病毒细胞培养、抗原检测、抗体检测及分子生物学检测等目前实验室常用诊断与分型方法及新进展作一综述。

一、病毒细胞培养

病毒细胞分离培养是实验室诊断 HSV感染最为敏感的方法,并可对其分离株进行分型。细胞培养是以组织活细胞为宿主,使活病毒得到扩增,引起细胞病变。虽然目前细胞培养被广泛当作是金标准[6],但因其实验条件要求严格、成本高、操作繁琐、周期长等原因,一般只用作科研或流行病学调查,而在临床常规应用有很大的局限性,不易开展。

二、HSV抗原检测

临床上常用酶联免疫吸附实验(ELISA)法进行皮损处标本的 HSV抗原检测,由于典型病例可表现为集簇性水疱、脓疱、溃疡、结痂、皲裂、毛囊炎、非特异性红斑等,取标本时用棉拭子吸取水疱液;溃疡取溃疡液或渗出液;结痂取痂皮;丘疹、红斑用钝刀刮取组织渗出液;皲裂用棉拭子用力擦拭取渗出液[7],然后可以采用双抗体夹心法(双次酶免反应放大技术)检测抗原,以同时检测HSV1型和 HSV 2型。国外研究表明,其敏感性为 93.7%,特异性为 97.9%[8]。

张俊等[7]报道 ELISA法检测不同类型的皮损,HSV抗原检出率有差异,水疱、溃疡、结痂、丘疹红斑和皲裂的 HSV抗原检出率分别为 83.7%、66.3%、34.6%、12.9%和 12.6%。可以看出典型疱疹皮损的 HSV抗原检出率较高,而疱疹后期皮损的HSV抗原检出率较低。这可能与水疱期发生于病程的早期,皮损较为新鲜,活动的 HSV量多、毒性强,而水疱破裂,病毒释放,皮疹处病毒逐渐减少等因素有关[9],总体来说,ELISA法检测HSV抗原的敏感性和特异性较强,具有方便、快速(大约 2h左右)等特点[8],适合大批量样本的检测,尤其适用于疱疹初期皮损明显的患者,值得临床推广使用,而对于敏感性相对较低的后期皮损标本,可以通过选择抗体检测或荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)加以弥补。

三、HSV血清特异性抗体检测

HSV原发感染后,机体迅速产生特异性免疫力而康复,且无明显症状。但大多数个体不能彻底清除病毒,病毒以潜伏状态长期存在宿主体内,而不引起临床症状。当宿主机体抵抗力下降时,潜伏状态的病毒被激活,转为增殖性感染,使机体产生病理性损害。HSV感染后产生的潜伏状态,使得正常的非发病人群仍有较高的 HSV抗体阳性率。血液中的抗体在病毒感染后 1周出现,3～4周达高峰,可持续多年[10]。

据费选文等[10]报道,正常人的 HSV 2 IgM阳性率为3.3%,HSV 2 IgG阳性率为 41.7%;患者 HSV 2 IgM阳性率为16.2%,HSV2 IgG阳性率为 62.9%。即患者的 HSV 2 IgM与IgG阳性率均高于正常人,其中以 HSV 2 IgM阳性率的差异更具显著性。报道还显示正常人群(包括无症状病毒携带者及潜伏感染者)的 HSV 2 IgG阳性率也处于较高水平,提示存在着既往感染或病毒潜伏的状态。研究认为 IgM特异性抗体是HSV2原发早期感染的指标,在首次感染后约 2～3d出现,一周左右达到峰值,此后IgM抗体水平维持一段时间,愈合期则快速下降,在感染 2周左右滴度可下降至检测不到的水平[11],潜伏期、无症状感染及复发时检测不出 IgM抗体。HSV2 IgG特异性抗体产生于首次感染后 7d左右,2周左右达到峰值,至愈合期维持平衡。当 HSV再次感染时特异性 IgG抗体迅速升高,并于一周内达到峰值,因此 HSV2 IgG是发现亚临床无症状HSV感染者及复发人群最可行的方法,对防止生殖器疱疹的性传播和母婴传播有重要意义。青春期后90%的人群HSV抗体阳性,胎儿与新生儿是否被感染主要取决于母亲孕期的感染类型及其免疫状态,约 75%新生儿的感染是经产道由HSV 2型感染引起的。多数 HSV 2型感染孕妇处于亚临床状态,很多新生儿HSV感染可以在生后很长时间才表现出临床症状或处于亚临床感染,很难早期诊断[12]。因此,早期对孕母进行HSV 2 IgG抗体检测就显得尤为重要,研究显示 HSV的隐性感染比有症状、体征的感染更常见,单纯依靠临床做出的诊断只能发现 HSV感染病例的 20%左右[13]。有国外学者通过临床跟踪随访发现,原来无症状或皮损的 HSV 2血清阳性者,75%在一年内有了症状或出现皮损[14]。另外,对皮损不明显且 HSV抗原检测阴性患者,血清HSV特异性抗体检测是一个很好的补充。因此通过血清HSV 2特异性抗体检测,对血清HSV 2抗体阳性者采取行为干预及治疗,对降低HSV传播的危险性及复发率具有十分重要的意义。HSV血清特异性抗体 IgG和IgM常用ELISA方法进行检测,近年来,HSV 2抗体ELISA诊断方法有了很大的发展,通过对微孔板进行重组糖蛋白 G2(gG2)抗原的包被,检测的敏感性和特异性有了很大提高[6]。

四、分子生物学检测

在分子生物学检测中主要应用聚合酶链反应(PCR)技术,包括多重 PCR、聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、套式 PCR、PCR-ELISA、PCR产物的微流控芯片技术、PCR产物的 DNA测序技术以及多重 FQ-PCR等[5,15～17],这些方法分别存在引物较多、成本高、操作较复杂、设备要求较高的缺点,因此临床实验室检测比较常用的有常规 PCR、PCR产物的 DNA测序以及 FQ-PCR法。

1.常规PCR法。常规 PCR方法可以快速检测标本中是否存在特定病毒,但由于病毒的变异性,以及 PCR引物选择的局限性,PCR反应的特异性完全取决于所设计的引物,另外,操作时要开盖检测PCR产物,因此在实践中可能会出现假阴性和假阳性的结果。目前已有逐渐被淘汰的趋势。

2.PCR产物的DNA测序。PCR扩增并测序的方法能够对标本中的 HSV进行检测和鉴定。通过测定序列与数据库的比较,确定在标本中是否有HSV。根据序列的差异,很容易区分病毒的种类及型别[18]。同时,根据序列比对,也能得知病毒在同种及相近病毒分子进化树中的位置,这对于分析病毒来源和变异等具有重要意义,因此DNA测序用于病毒鉴定和分型,是一种准确有效的方法。此法在实验条件及实验技术上要求严格,成本也比较高,目前难以在临床上推广。

3.FQ-PCR。FQ-PCR是目前比较先进的分子生物学技术,具有特异性强、灵敏度高等优点,FQ-PCR应用荧光探针技术,可以通过光电传导系统直接探测 PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,该技术已被应用于HSV病原体的检测[5]。FQ-PCR方法通过选择 HSV1和 HSV2的糖蛋白B基因,设计一对通用引物和对应的探针组建 2个FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品制作标准曲线,进行重复性和敏感性试验,以其他种类的细菌、病毒、真菌进行特异性分析。此法无需开盖检测PCR产物,避免了传统 PCR易发生假阳性污染的缺点,增强了特异性和准确性[19]。陈刚等[20]报道皮损组织液、生殖道分泌物标本中 HSV DNA检出阳性率分别为 91.5%(75/82)和 24.2%(64/265),说明有典型皮损的患者 HSV DNA的检出率要远远高于无皮损或皮损不明显的患者,且在正常人标本中均未检出 HSV DNA,说明该方法检测特异性强。FQ-PCR可对靶核酸定量,通过连续测定患者治疗过程中分泌物的 HSV DNA值,可为临床疗效观察提供参考。但标本的取材量会影响到测定的数值,临床在分析结果时要考虑取材量的影响,FQ-PCR方法从处理标本到核酸扩增分析所需时间为 2 h左右,该方法用于 HSV DNA的检测,能快速、准确地为临床提供可靠的病原学诊断依据,有助于HSV感染的流行病学和病理机制的研究。

总之,随着HSV检测技术的不断深入与完善,将会有更具优势的HSV检测技术出现,更好地为临床诊断及科学研究服务。

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