鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展

张大丙

(中国农业大学动物医学院,北京海淀 100193）

鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的重要传染病。近两年来,国内外对该病病原开展了分子生物学研究,本文描述了病原的血清型、分类地位、基因组结构、基因组变异性等方面的研究进展。

1 血清型及分类地位

鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV）是鸭病毒性肝炎的致病病原[1],历史上被分为3个血清型(1～3型）,最初均被假定为小 RNA病毒科成员[2-3]。按国际病毒分类委员会(ICTV）第八次分类报告,血清1型(DHV-1）和3型(DHV-3）属于小RNA病毒科的2个病毒种[4],而血清2型(DHV-2）属于星状病毒科禽星状病毒属的成员,并已被改称为鸭星状病毒1型(duck astrovirus 1,DA stV-1）[5]。最近的结果表明,传统的血清2型和3型均属星状病毒[6],应从DHV的血清型中排除。

2007年,研究者分别在台湾和韩国鉴定出DHV的新血清型,暂称之为“台湾新型”和“韩国新型”,2个新型之间的血清学关系尚不清楚,但它们均不与DHV-1产生交叉中和反应[7-8]。DHV-1、“台湾新型”和“韩国新型”三者之间在衣壳蛋白编码区存在较高的变异性(28%～32%的P1核苷酸序列差异和21%～27%的P1氨基酸序列差异）[9],据此可认为它们属于不同的血清型。

血清1型[10-12]、“台湾新型”[7]和“韩国新型”[8]DHV均具有典型的小RNA病毒基因组结构,但它们与小RNA病毒科9个已知属病毒之间的衣壳蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%,应被归属于小RNA病毒科的一个新属,ICTV小RNA病毒研究组建议称之为禽肝病毒属(avihepatovirus）(http://www.picornaviridae.com）。

按照现有的知识可认为,鸭病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒属鸭肝炎病毒的3个型和星状病毒科禽星状病毒属的2种鸭星状病毒引起,故在描述该病病原时易出现混淆:(1）作为星状病毒[6],DHV-3仍在使用[4]。(2）在ICTV第八次报告中,DHV-1是一个病毒种[4],但DHV-1通常又指DHV的血清1型;当出现新的血清型时(如“台湾新型”和“韩国新型”）,传统的血清1型和新的血清型如何称呼?是将它们称为DHV的不同血清型还是DHV-1的不同血清型?

为避免混淆,可引入一个新的病毒种名,即鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV）[13],既可与鸭星状病毒相区分,亦可与鸭乙肝病毒相对应,还便于对该病毒的不同血清型进行命名。因此,作为鸭病毒性肝炎的病原之一,DHAV特指小 RNA病毒科禽肝病毒属的成员。可用DHAV-1代表传统的血清1型,如果血清学试验结果最终表明“台湾新型”和“韩国新型”缺乏血清学相关性,则分别称之为血清2型(DHAV-2）和血清3型(DHAV-3）[13]。进化分析中,血清1型、“台湾新型”和“韩国新型”分属3个不同的基因型,即 A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和 C型(DHAV-C）[9]。目前,分子生物学技术的运用日益广泛,若用基因型描述DHAV不同毒株的型别更为方便。

2 基因组结构

DHAV有小RNA病毒的基因组基本结构,即仅含一个大的 ORF,其两侧分别是 5′UTR和3′UTR,3′UTR 之后是poly(A）尾。ORF编码一个聚蛋白,从 N端到C端方向,分别为结构蛋白区(P1）和两个非结构蛋白区(P2和P3）。预测P1区裂解为3种衣壳蛋白(VP0、VP3和VP1）,P2区裂解为4种或5种非结构蛋白(2A 1、2A 2或2A 2+2A 3、2B和2C）,P3区裂解为4种非结构蛋白(3A、3B、3C和3D）[7-8,10-12]。与多数小 RNA病毒相比,DHAV的基因组有其自身的结构特点,例如VP0缺乏成熟切割、含有不同2A蛋白的组合、拥有小RNA病毒科中最长的 3′UTR。不同研究者对IRES的类型、L蛋白的有无和2A蛋白的数量等3个方面的分析结果尚未取得一致的意见。

小RNA病毒的5′UTR至少存在两个功能域,其5′端与病毒RNA的复制有关,3′端则含有与起始蛋白质翻译有关的IRES。目前,在小RNA病毒中发现了4种不同类型的IRES。肠道病毒和鼻病毒的IRES属于Ⅰ型,口蹄疫病毒、心病毒、人双埃柯病毒(human parechovirus,HPeV）和ljungan病毒(ljungan virus,LV）的IRES属于Ⅱ型,甲肝病毒的IRES属于Ⅲ型,而猪捷申病毒Ⅰ型(porcine teschovirus 1,PTV-1）与黄病毒科丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV）相似,其IRES属于Ⅳ型。Kim MC等(2006）、Tseng C H 等(2007）和 Tseng C H和Tsai H J(2007）认为:DHAV可能与 LV和HPeV类似,拥有Ⅱ型IRES[7,11-12]。但Ding C和Zhang D(2007）则认为:DHAV的IRES可能属于Ⅳ型 。其原因是:在DHAV 的 5′UTR 中,存在非典型的 Yn-Xm-AUG基序(Y5-X5-AUG或 Y 7-X71-AUG）,并不符合 Ⅱ型 IRES的特征。比较5′UTR的序列可以发现,对应于Ⅳ型IRES中构成Ⅲe域的区域,DHAV和HCV的12个碱基完全一致,而DHAV与PTV-1的12个碱基仅存在一个碱基的差异。同时,对应于Ⅳ型IRESⅢe域的下游序列及Ⅲ域的上游序列,DHAV的5′UTR序列亦可以互补配对形成一个类似于HCV和PTV-1Ⅲf域的假结[10]。

Kim MC 等(2006）、Tseng C H 等(2007）、Tseng C H和Tsai H J(2007）和Kim MC等(2007）认为,DHAV基因组ORF的5′端不编码L蛋白[7-8,11-12],但分析结果显示,所有DHAV毒株聚蛋白N端的31-35均为GA/VVES序列,与其他小RNA病毒VP0/VP4蛋白N端的豆寇酰化信号序列(GxxxS/T）相符,因此,Ding C和 Zhang D(2007）预测在DHAV的N端存在一个短的L蛋白,含30个氨基酸[10]。

和LV类似,DHAV的2A蛋白由结构上不同的蛋白组成。Kim MC等(2006）、Ding C和Zhang D(2007）认为,DHAV的2A蛋白是由20个氨基酸的口蹄疫病毒样2A 1与285个氨基酸的人双埃柯病毒样2A 2组成,在2A 2的N端存在一个AIG1保守域[10-11]。和LV的2A 2蛋白相比,DHAV的2A 2蛋白在N端长出161个氨基酸,Tseng C H等(2007）、Tseng C H 和 TsaiH J(2007）认为,这多出的161个氨基酸将会形成一种成熟的蛋白(2A 2）,而剩下的124个氨基酸则形成另外一种成熟蛋白(2A 3）[7,12]。

3 变异性

根据衣壳蛋白编码区的序列同源性和进化分析的结果,可将DHAV区分为3个基因型,Wang L等(2008）称之为A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和C型(DHAV-C）[9]。在VP1区,型内核苷酸和氨基酸序列同源性分别≥90%和92%,型间核苷酸和氨基酸序列同源性分别≤72%和79%;在VP0区,型内核苷酸和氨基酸序列同源性分别≥92%和96%,型间核苷酸和氨基酸序列同源性分别≤73%和81%;在VP3区,型内核苷酸和氨基酸序列同源性分别≥91%和95%,型间核苷酸和氨基酸序列同源性分别≤74%和83%。说明DHAV的衣壳蛋白编码区序列在型内高度保守,在型内具有较高的变异性。

在非结构蛋白编码区,型内序列亦高度保守(核苷酸和氨基酸序列同源性分别≥91%和94%）,型间情况则有所不同。在核苷酸水平,型间各非结构蛋白编码区的序列变异性均较高(同源性为67%～85%）;在氨基酸水平,DHAV-B和DHAV-C之间各非结构蛋白的序列均较保守(同源性为90%～97%）,但比较这两个基因型与DHAV-A之间的关系,可见2A和3AB蛋白的氨基酸序列变异性较高(同源性为 70%～77%）,而 2B、2C、3C和 3D蛋白的氨基酸序列则较为保守(同源性为86%～93%）。

两个非翻译区的核苷酸序列在型内亦高度保守(序列同源性≥93%）。在型间,5′UTR序列高度变异(序列同源性为 69%～74%）,对于 3′UTR,DHAV-B和DHAV-C之间较为保守(序列同源性为89%～92%）,但它们与DHAV-A之间均表现出较高的变异性(序列同源性为63%～70%）。

3个型DHAV在基因组长度亦表现出差异。不计poly(A）尾,DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C的基因组长度分别为7 689-7 691 nt、7 769 nt和7 773～7 775 nt。不同基因型DHAV基因组长度差异源于3个基因区:VP1、5′UTR和3′UTR。

DHAV-A和DHAV-B的VP1长714 nt,编码238个氨基酸的 VP1蛋白[7,10-12],而 DHAV-C的VP1长720 nt,编码240个氨基酸的VP1蛋白[8]。因此,DHAV-C的ORF(6 756 nt）比DHAV-A和DHAV-B的ORF(6 750 nt）长6个碱基,编码的聚蛋白(2 251 aa）比DHAV-A和DHAV-B的聚蛋白(2 249 aa）多2个氨基酸。

不同基因型之间,5′UTR和3′UTR中存在广泛的插入/缺失,相对于 DHAV-A,DHAV-B和DHAV-C的两个非翻译区更长,而 DHAV-B和DHAV-C的两个非翻译区的长度相似。DHAV-A的5′UTR 和 3′UTR 分别长 625-626 nt和 314-315 nt[10-12],DHAV-B的5′UTR 和3′UTR 分别长653 nt和 366 nt[7],而 DHAV-C 的 5′UTR 和3′UTR的长度分别为651-652 nt和366-367 nt。

4 展望

DHAV分子生物学研究工作的开展对于确定该病毒的分类地位,进一步研究该病毒的分子致病机制奠定了良好的基础。DHAV的基因组序列特点则有利于建立快速的分子检测和分型方法。基于5′UTR部分序列的分析结果,已确定我国多个地区同时流行DHAV-A和DHAV-C[13]。进一步开展DHAV的分子流行病学研究可较全面的掌握我国DHAV的血清型/基因型分布,其结果对于有效控制我国鸭病毒性肝炎的发生和流行具有重要意义。

[1] Levine P P,Fabricant J.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America[J].Cornell Vet,1950,40:71-86.

[2] Asplin F D.Duck hepatitis.Vaccination against tw o serological types[J].Vet Rec,1965,77:1529-1530.

[3] H aider S A,Calnek BW.In-vitro isolation,propagation and characterisation of duck hepatitis virus typeⅢ[J].Avian Dis,1979,23:715-729.

[4] Fauquet C M,Mayo A,Maniloff J,et a l.V irus Taxonomy[M]//Eighth Report of the InternationalComm ittee on Taxonomy of Viruses.Calif:Elsevier Academ ic Press,2005:757-778.

[5] Fauquet C M,Mayo A,Maniloff J,et a l.V irus Taxonomy[M]//Eighth Report of the International Comm ittee on Taxonomy of Viruses.Calif:Elsevier Academ ic Press,2005:859-864.

[6] Todd D,Smyth V J,BallNW,eta l.Iden tification of chicken en terovirus-like viruses,duck hepatitis virus(DHV）type 2 and DHV type 3 asastroviruses[J].Avian Pathol,2009,38:21-30.

[7] Tseng C H,Tsai H J.Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J].Virus Res,2007,126:19-31.

[8] K im MC,Kw on Y K,Joh S J,etal.2007.Recent Korean isolates of du ck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotypew hen compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J].A rch Virol,2007,152:2059-2072.

[9] Wang L,Pan M,Fu Y,eta l.Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J].V irus Genes,2008,37:52-59.

[10]Ding C,Zhang D.Molecular analysisof du ck hepatitis virus 1[J].Virology,2007,361:9-17.

[11]Kim MC,Kwon Y K,Joh S J,et al.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage c lose to the genus Parechovirus in the fam ily Picornaviridae[J].J Gen V irol,2006,87:3307-3316.

[12]Tseng C H,Know les N J,Tsai H J.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J].Virus Res,2007,123:190-203.

[13]Fu Y,Pan M,W ang X,et al.Molecu lar detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens[J].Vet Microbiol,2008,131:247-257.