反刍动物瘤胃内氨氮产生的微生物机制与调控手段

浙江大学奶业科学研究所 林波 王迪铭

反刍动物与单胃动物氮代谢最大的不同在于其瘤胃内微生物可将部分饲料蛋白质或其他含氮物质发酵成氨氮，而一部分饲料蛋白质则被降解成氨基酸和多肽。微生物则利用分解产生的氨氮、氨基酸和多肽重新合成微生物蛋白质，被动物利用（冯仰廉，2004）。瘤胃氨氮为反刍动物微生物提供无机氮源的同时，也因部分饲料优质蛋白质被降解，从而造成饲料蛋白质的浪费 （Bach等，2005；卢德勋，2004），而蛋白质原料是饲料中价格比重最大的部分。高蛋白质会导致：（1）高尿氮排放引起的环境污染；（2）高血浆尿素氮引起的繁殖性能低下；（3）瘤胃鼓气等。因此，在满足瘤胃内微生物对氨态氮需求的情况下尽可能避免饲料蛋白质在瘤胃分解，是提高反刍动物对饲料蛋白质利用率的有效方法 （Bach等，2005；Morrison和Mackie，1996）。本文对参与蛋白质降解和氨氮生成的瘤胃内主要微生物作了简述，并对几种通过微生物调控而抑制瘤胃蛋白质降解的手段进行总结。

1 瘤胃内蛋白质降解和氨生成

瘤胃内蛋白质的降解是许多不同的微生物分泌的酶共同参与的复杂过程，这些酶为胞联酶，其作用有赖于微生物对饲料的附着。蛋白质在瘤胃内被水解成多肽、二肽或三肽后继续被水解成氨基酸，最终被发酵成氨氮，氨氮作为微生物生长和蛋白质合成的重要氮源（Firkins等，2007）。瘤胃中细菌、原虫和真菌等均可参与蛋白质水解成多肽反应，由多肽到氨的反应几乎都是在细菌的参与 下 完 成 （Morrison 和 Mackie，1996；Wallace，1996），原虫虽具有较强的脱氨基活性，但由于其数量有限而作用不明显。微生物是瘤胃内饲料蛋白质降解的主导性因素，研究瘤胃内微生物对蛋白质的降解机制有利于提高饲料蛋白质的利用效率。

2 几种关键微生物在瘤胃蛋白质降解和氨氮生成中的作用

2.1 瘤胃真菌 瘤胃真菌在纤维降解和淀粉降解中起着重要的作用，但在瘤胃微生物中，其蛋白质水解活性则相对较低。Michel等（1993）体外研究了7株瘤胃具有代表性真菌的蛋白质水解能力，包括氨基肽酶、肽链内切酶、羧肽酶的活性，其中只有一株真菌具有酪蛋白水解活性，这株菌属于Piromyces属、所有菌株均未发现羧肽酶活性，但均具有氨基肽酶活性，只有两株具有肽链内切酶活性。可见，真菌在瘤胃内也参与了蛋白质降解过程，但由于瘤胃真菌的研究较晚，有关真菌对瘤胃蛋白质降解的报道还相对较少。

2.2 瘤胃原虫 长期以来，原虫都被认为是瘤胃氮代谢低效率的主要原因（王梦芝等，2008）。相比细菌只降解可溶性蛋白质而言，原虫既可以降解可溶性蛋白质，也可以降解不溶性蛋白质，原虫在脱氨基作用中也占据了重要位置，瘤胃原虫脱氨酶的活性较细菌高3倍。同时，原虫不能利用瘤胃氨氮，但其分解不溶性蛋白质的能力和脱氨基活性极大地促进了氨氮产生（林波和陆燕，2009）。此外，原虫对瘤胃细菌的吞噬作用使微生物蛋白质在瘤胃内形成了大量无效的微循环，从而降低了饲料蛋白质的利用效率（Jouany，1996）。 因此，原虫被认为是瘤胃内氨氮净产生微生物。但近来研究发现，细菌可通过水平基因转移（HGT）使瘤胃原虫获得氨氮利用的基因（Newbold等，2005），对瘤胃原虫400个表达序列标签测序表明，四种与氨氮利用有关的酶可能来自于瘤胃细菌，说明原虫也可能利用部分氨氮，但量很少（Garcia-Vallve等，2000）。现已经研究证实，具有原虫的瘤胃内氨氮浓度是驱除原虫的瘤胃内氨氮浓度的2倍（Firkins等，2007）。虽然抑制原虫可以显著降低瘤胃氨氮浓度，但目前关于驱原虫对瘤胃氮代谢的促进作用尚有争议，王梦芝等（2008）和卢德勋等（1993）认为，根据日粮种类的不同，部分驱除原虫可提高蛋白质过瘤胃率。

2.3 瘤胃细菌 瘤胃细菌对蛋白质的降解是相互协同的关系，不同菌种分别参与了蛋白质降解成氨氮的不同阶段反应，从而使得饲料蛋白质的瘤胃降解顺利进行。研究发现，栖瘤胃普雷沃氏菌、瘤胃高效产氨菌及其他蛋白质分解菌在蛋白质到氨氮的降解过程中起到了重要作用。

2.3.1 栖瘤胃普雷沃氏菌 栖瘤胃普雷沃氏菌（Prevotella sp），不仅数量大，参与了蛋白质降解级联过程中的每一步，而且其还是唯一被发现具有二肽酶活性的瘤胃微生物。二肽酰肽酶活性是寡肽在瘤胃液中被降解的重要原因，拥有二肽酰肽酶活性的微生物并不多 （Morrison和Mackie，1996；Wallace等，1985）。常见的细菌寡肽酶是氨酰肽酶，其作用是从N端依次切下一个氨基酸，而二肽酰肽酶活性常见于哺乳动物中，从N端依次切下一个二肽。瘤胃内二肽酰肽酶活性使得瘤胃液中形成较多的二肽或三肽，然后进一步被二肽酶或三肽酶分解成游离氨基酸 （Wallace等，1996）。根据16S rDNA序列分析，可将栖瘤胃普雷沃氏菌分为4类，这4类都能产生二肽基肽酶，其中一类P.albensis，能产生至少4种不同的酶类，且均为丝氨酸蛋白酶，这些酶对抑制剂的特异性和敏感度不尽相同（Avgustin等，1994）。研究表明，对体外瘤胃发酵系统添加可抑制栖瘤胃普雷沃氏菌二肽酰肽酶活性的物质可降低瘤胃肽的降解，从而降低氨氮产量。

2.3.2 瘤胃高效产氨菌 氨氮主要由瘤胃细菌的脱氨基作用产生，瘤胃中大部分的细菌具有脱氨作用。瘤胃内的脱氨基作用是由两种不同的细菌主导的，其中一类数量巨大，包括瘤胃内的一些主要菌群，但每种细菌的脱氨基活性并不高；第二类种群数量较少，但每种细菌均具有很高的脱氨基活性和特异性，统称为高效产氨菌（HAB）（Russell等，1991）。它们的生长依赖于氨基酸作为碳源和氮源，该种群数量的减少将引起氨氮的降低，它们一个共有的特征是对莫能菌素敏感，因而莫能菌素添加可显著降低瘤胃氨氮产量 （Attwood等，1998）。此外，该类菌的活性对低pH值比较敏感，最近研究表明，来自饲喂高精料奶牛的混合瘤胃细菌产生氨氮的速度比饲喂高粗日粮的奶牛瘤胃细菌低50%，其原因可能是饲喂高精日粮的奶牛pH值低于高粗日粮。由于HAB需要依赖于水解蛋白和大的多肽片段来获得生长所需的小肽和氨基酸，因此，HAB有可能同蛋白降解菌紧密联合在一起以获取所需底物（Attwood等，1998）。虽然瘤胃HAB有共同特征，但很难从分类学给予界定，研究表明，HAB有多种代谢类型，并且基因型也有较大差异，其中某些属于不发酵糖的类型、某些是发酵糖或专性利用蛋白的菌种（Eschenlauer等，2002）。因此，由于HAB的多样性，目前关于瘤胃HAB的研究还相对较少。

2.3.3 其他蛋白质分解菌 瘤胃内其他蛋白质分解菌包括溶纤维丁酸弧菌 （Butyrivibri fibrisolvens）、 嗜淀粉瘤 胃杆菌 （Ruminobacter amy-lophilus）以及芽孢梭杆菌属（Clostridium sp.）、反刍动物真杆菌（Eubacterium ruminantium）、梭杆菌属（Fusobacterium sp.）、反刍动物新月单胞菌（Selenomonas ruminantium）和牛链球菌（Streptococcus boris） 的某些菌株 （冯仰廉，2004；Wallace 等1988）。各种细菌在蛋白质降解的过程是协同和互补的关系，从而可有效降解饲料蛋白质。例如，牛链球菌含有较高亮氨酸氨基肽酶活性，对于反刍动物新月单胞菌较低的内肽酶活性是一个互补。嗜淀粉瘤胃杆菌（R.amylophilus）、溶纤维丁酸弧菌（B.fibrisolvens）是目前研究较多的两种蛋白质降解菌。嗜淀粉瘤胃杆菌是已知的蛋白质降解活性最高的菌株之一，同时它具有很强淀粉分解能力，所以在淀粉日粮的蛋白质分解中起到了重要作用。溶纤维丁酸弧菌是从动物中分离的最主要的蛋白质分解菌，兼有纤维降解功能，当日粮中存在许多不易被降解类型的蛋白质时，该菌会大量繁殖。目前，瘤胃内嗜淀粉瘤胃杆菌和溶纤维丁酸弧菌的荧光定量PCR定量检测方法已经建立，这两种细菌常作为评价不同日粮（精料和粗料）条件下，瘤胃内蛋白质降解菌变化情况的代表菌株（徐爱秋等，2010）。

3 瘤胃内氨氮生成的微生物调控手段

影响瘤胃内蛋白质降解率的因素有很多，日粮组成是决定性因素，但日粮蛋白质的降解则是通过瘤胃微生物来完成（Bach等，2005）。因此，调控瘤胃微生态区系是最终达到瘤胃蛋白质降解有效调控的手段。

3.1 离子载体及其他添加剂对瘤胃产氨菌的抑制 莫能菌素、拉沙里菌素、泰乐菌素、海南霉素、维及尼霉素等离子载体可抑制瘤胃氨氮的生成（沈赞明，2004；Wallace 等，1992）。 莫能菌素可降低高效产氨菌产氨氮的作用。但有的产氨菌可通过在细胞外形成一层包膜来产生对莫能菌素的耐受性（Callaway 等，1999）。Flythe 等（2009）对波尔山羊瘤胃内产氨菌的培养试验发现，P.indolicus相似性菌种对莫能菌素的抵抗能力较强。因此，虽然莫能菌素可作为抑制瘤胃产氨菌的手段之一，但应与其他手段结合且不宜长期使用。随着绿色养殖观念的深入，莫能菌素等抗生素的应用已经受到较大限制，而植物挥发油作为一种天然抗菌成分，近年来在瘤胃发酵调控领域受到广泛关注（林波和陆燕，2009）。研究表明，挥发油具有抑制瘤胃高效产氨菌，降低瘤胃氨氮浓度的作用（林波等，2010；Benchaar 等，2008；McIntosh 等，2003）。Calsamiglia等（2007）认为，挥发油在瘤胃内主要抑制高效产氨菌和原虫，而这两种微生物均是瘤胃氨氮产生的主要微生物，因此，挥发油降低氨氮的作用机制与离子载体类抗生素具有相似性。但挥发油种类繁多、结构和作用机制各异，浓度是决定其作用效果的关键因素，高浓度挥发油会抑制瘤胃真菌等纤维降解微生物，从而导致瘤胃发酵的 全 面 抑 制 （Alexander 等 ，2008；Busquet 等 ，2006）。皂甙作为一种瘤胃发酵调控剂，也可抑制瘤胃氨氮产生。研究表明，在体外添加茶皂素可降低原虫数量，降低氨氮产量，且对瘤胃挥发性脂肪酸无明显抑制（Guo 等，2008；Hu 等，2005），而体内试验也表明，茶皂素抑制了瘤胃蛋白质的降解（Mao 等，2010；Yuan 等，2007）。 酵母培养物是一种有效的瘤胃发酵调控剂，可促进微生物生长。大量研究表明，酵母培养物可显著降低瘤胃内NH3-N 浓度（Kumar等，1994；Williams等，1990），但也有研究表明，酵母或酵母培养物添加对瘤胃蛋白质降解没有影响（Jouany等，1998）。与挥发油和皂甙类物质相比，酵母培养物降低瘤胃氨氮的机制在于促进微生物的瘤胃氨氮利用。

3.2 瘤胃细菌分泌的细菌素 细菌素是由细菌基因组编码，在核糖体内合成后分泌的一种蛋白质或多肽内抑菌物质，其特点是对亲缘关系较近的细菌有抗菌作用，产生菌对细菌素有自身免疫性，但某些细菌素的抗菌范围不局限于同源的细菌。细菌素选择抑制性较强，而敏感菌不产生耐药性（Cleveland等，2001），在维持动物消化道微生态平衡中发挥了重要作用。瘤胃细菌素在瘤胃内广泛存在，并已证明其是维持瘤胃微生态平衡的重要调控因子。通过直接或间接使用瘤胃细菌素调节瘤胃微生物区系的平衡和替代抗生素调控瘤胃发酵是一个具有潜力的研究领域。相比挥发油，莫能菌素等瘤胃发酵调控剂会显著抑制真菌和原虫等纤维降解微生物，细菌素只针对细菌，对真菌和原虫等其他瘤胃菌群无影响。此外，细菌素极强的选择抑制性为特异性抑制瘤胃产氨菌提供了前提保证。Callaway等（1999）报道，几种严格发酵氨基酸的细菌可被nisin抑制，Rychlik和 Russell（2002）也报道，将发酵碳水化合物的细菌和以氨基酸为底物的细菌在瘤胃液中共培养时，碳水化合物发酵细菌分泌的细菌素会抑制产氨菌的活性。其他一些研究表明，饲喂高精料日粮的牛瘤胃内产氨菌活性低于高粗日粮的牛，原因可能是饲喂高精日粮的牛瘤胃中溶纤维丁酸弧菌（B.fibrisolvens）可产生一种细菌素，从而显著抑制了瘤胃高效产氨菌的发酵，体外试验表明，细菌素和乳酸链球菌素可降低瘤胃甲烷和氨氮产量（Mantovani和Russell，2002）。由于细菌素作为瘤胃微生态调控剂的诸多优势，采用分子生物技术克隆表达特异性抑制普雷沃氏菌等产氨微生物的细菌素，或应用转基因技术开发表达特异性细菌素的基因工程菌，将是较有前景的研究领域。

3.3 化学修饰的多肽或蛋白质添加剂 离子载体类抗生素或植物挥发油可降低瘤胃氨氮的产量，但其抗菌活性范围较广，在瘤胃内可能会抑制某些纤维降解微生物，从而产生不利影响。另一种可特异性调节瘤胃蛋白质降解的方法是利用产氨微生物一般以多肽为底物的代谢特异性，在多肽引入具有微生物抑制性的化合物，从而选择性抑制瘤胃蛋白质降解微生物。Floret等（1999）报道，在羊日粮中添加一种氨基酸类似物，显著降低了瘤胃高效产氨菌的活性，体外试验也表明，其可降低以Trypticase和酪氨酸水解产物为底物发酵液氨氮产量，说明该物质具有选择性抑制瘤胃高效产氨菌的活性。此外，采用几种含多聚阳离子的合成鲑精蛋白多肽对普雷沃氏菌的纯培养进行研究，结果表明，在鲑精蛋白多肽最小抑菌浓度下，该菌对细菌素novobiocin的敏感性增加4倍，对莫能菌素的敏感性增加10倍。由于两种细菌抑制剂的作用机制完全不同，因此推测鲑精蛋白的作用可能在于使得该菌的膜对疏水性抗生素的亲和性增加，从而增强细菌对抗生素的敏感性。考虑到一些谷物含有多聚阳离子蛋白质，因此瘤胃谷物蛋白消化率的变化可能是由于各种谷物中多聚阳离子蛋白的多寡对瘤胃产氨菌的抑制不同有关 （Madeira和Morrison，1997）。关于含微生物抑制物质的化学修饰性多肽和蛋白质对瘤胃蛋白分解菌的抑制研究还较少，但其是一个较有发展前景的瘤胃蛋白质降解调控手段，有待进一步研究。

4 小结

蛋白质的瘤胃消化是反刍动物独特的消化特点之一，其在反刍动物营养中占据了重要位置。微生物是瘤胃蛋白质消化的主体，同时也是动物可代谢蛋白质的重要来源，因此，研究瘤胃内微生物对饲料蛋白质的降解和利用机制是调控反刍动物氮代谢的基础。由于瘤胃内参与饲料蛋白质降解和利用的微生物复杂多样，因此实现瘤胃蛋白质代谢调控的前提是阐明各种蛋白质降解微生物的种类和特点。近年来，随着基因组学、纯培养技术、微生物分子生物的研究进展，瘤胃微生物对纤维、淀粉等营养物质的消化机理逐渐被揭示，可以预见，微生物对饲料蛋白质的降解和氨氮产生的机制将是今后研究的热点。

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