中药复方药效物质基础研究进展Δ

彭苗苗，方 芸（1.南京中医药大学中西结合临床医学院，南京市 210008；2.南京市鼓楼医院，南京市210008）

中药药效物质基础研究是中药现代化战略的重中之重，其本质是寻找一种可以发挥综合药理作用的特殊的化学药物整体。如今，各种新兴技术的发展为中药复方药效物质基础的研究提供了有力工具，如膜分离、血清药理学、血清药物化学、药动学、生物膜色谱、Caco-2细胞、指纹图谱、计算机学和高通量筛选等技术的发展以及天然组合化学库和中药多靶点作用机制、系统生物学、化学物质组学等理论体系的发展，使药效物质基础研究取得了长足进步。本文着重就有关研究方法技术及理论体系进展作一综述。

1 研究技术和方法

1.1 体内化学成分研究方法

体内化学成分研究的方法有血清药理学、血清药物化学及药动学。血清药理学与血清药物化学的紧密结合，有助于中药药动学的研究和中药药效物质基础的阐明。而中药药动学的研究又对血清药理学和血清药物化学提出了更高的要求。

血清药理学最早是由日本学者田代真一在20世纪80年代提出并应用于中药方剂有效物质基础研究的，其理论依据是中药成分虽然复杂，但进入体内且被测到的化学成分数目是有限的。体内复方来源的化学成分，可以代表方剂整体药效，其体内药动过程和药效存在相关性，因此可以用含有有效成分的血清进行药效学研究，分析复方成分变化引起的效应改变。曹宜等[1]用血清药理学的方法研究茵陈蒿汤提取物的保肝作用，提示茵陈蒿汤的保肝物质是醇溶性的，且是其中极性比较小的部分。但血清药理学缺点在于血清中成分不清楚，还是一种“黑箱”操作，因此还需借助血清药物化学进行研究。

中药血清药物化学是在全面分析中药入血成分的基础上，通过药效相关性实验确定真正的有效成分，并对有效成分的体内动态、代谢及消长规律进行研究，从而阐明整个复方的药动学特征。窦志华等[2]对复方五仁醇胶囊进行了血清药物化学研究，用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法，比较复方五仁醇胶囊含药血清色谱图和空白血清色谱图，分析该制剂给药后血清中产生的药源性成分。静脉给药后血清中产生的13个药源性成分全部来自君药五味子，这些成分可能是复方五仁醇胶囊体内直接作用物质。王喜军等[3]对六味地黄丸进行血清药物化学研究，口服后发现了11个入血成分，其中4个为新产生的代谢产物，7个为六味地黄丸体外所含成分的原型。

中药血清药物化学推动了中药药动学的发展。中药药动学主要研究中药有效成分、单方及复方体内过程动态变化的规律，并将研究结果用数学方程和相关药动学参数来表达。如，曾俊芬等[4]对生化汤的药动学参数进行研究，用HPLC法测定阿魏酸的含量，得知兔口服生化汤后体内阿魏酸的分布代谢呈二室模型，其达峰时间为11.69分钟。

1.2 生物膜色谱法

中药提取物不经分离直接与模拟生物膜结合，能够很好地阐明中药多成分、多靶点协同作用的特点。由于模拟生物膜可以通过改变相关的影响因子很方便地模拟人体的生理环境，而且有较好的稳定性，因此为研究药物在体内的吸收以及活性成分的筛选提供了一种简便的模型。

1995年，Beigi F等[5]首次采用凝胶作为载体、利用固定化的脂质体作为固定相，模拟小肠上皮细胞对药物的吸收过程。随后，国内的毛希琴等[6]对这一方法进行了改进，建立以涂敷磷脂的硅胶作为模拟生物膜的固定相，用于预测药物的小肠吸收，并且将该技术成功应用于单味中药的研究。齐炼文等[7]将脂质体作为模拟生物膜，采用平衡透析与液相色谱联用技术，建立了一种研究中药成分与模拟生物膜之间相互作用的新方法。该方法可用于预测药物在体内的吸收情况，进而研究中草药及复方的药效物质基础。毛希琴等[8]采用涂敷磷脂的硅胶为模拟生物膜色谱固定相，与传统的凝胶载体相比固定相的机械强度及磷脂固载能力均有较大提高，且有较好的稳定性，用3种缓冲条件模拟小肠吸收的缓冲环境，同时涂敷磷脂形成的脂环境能够较好的模拟细胞膜所起的作用，使得用色谱模型预测药物小肠吸收的准确程度有了很大提高。

1.3 Caco-2细胞技术

Caco-2细胞模型是一种在体外研究药物分子穿越特定生物屏障进行转运的新工具。由于具有体内肠上皮的许多形态和功能上的性质，它为研究药物的转运机制、预测药物的小肠吸收情况以及药物在肠道的代谢提供了基础。Caco-2细胞模型被认为是目前最好的体外吸收模型，可用于快速评估新药的细胞渗透性，阐明药物转运的途径，评价提高膜通透性的方法，确定被动扩散的药物最合适的理化性质和评估新药的潜在毒性作用等，成为药物吸收研究的必备手段。

经典的Caco-2细胞模型是在Transwell板上培养单层Caco-2细胞，多用于单体药物吸收的研究。董倩倩等[9]将Caco-2细胞模型进行改良，加大细胞量，直接进行丹参成分的吸收研究，并结合液-质联用技术，将可吸收成分的筛选和鉴定结合起来，为复杂的中药体系活性物质体外筛选提供了一个途径。Boyer J等[10]利用单层Caco-2细胞研究苹果和大葱匀浆中槲皮素苷和苷元的吸收。结果表明，经乳糖酶处理的苹果和大葱匀浆可以增加槲皮素的生物利用度。可见，Caco-2细胞模型为检测黄酮葡萄糖苷从食物吸收的生物利用度提供了可靠的体外模型。

1.4 指纹图谱技术

中药材或中成药经过适当处理后，利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数据，称为中药指纹图谱[11]。对于中药的多成分和整体作用，应该用指纹图谱的方法来控制中药直接提取物中的尽量多的成分。它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效，为中药复方物质基础的研究提供科学性和合理性。现阶段中药的有效成分大多尚未明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好符合中药质控整体性的要求，较之单一成分或指标成分的质控方法，更具有科学性和全面性。

目前，指纹图谱的测定多采用HPLC法。梁生旺等[12]采用HPLC法分析，获得金银花不同提取部位的指纹图谱，同时选择小鼠耳肿胀抗炎实验测定不同提取部位的药理活性，以线性回归解释化学信息和药理活性的相关关系。结果，以甲醇提取部位的药理活性最强，故以此部位的HPLC图谱来制定金银花的“药谱”。李康等[13]在减味藿香正气水药效物质基础的研究中得出色谱峰X3和X25所代表的化学成分量的增加能增强对乙酰胆碱刺激的家兔离体兔肠的抑制作用强度，确定X3和X25代表的化学成分为该药对家兔离体兔肠抑制的药效物质基础。但是在中药指纹图谱中，可能还含有很多未知化合物，该对它们如何处理还是一个尚待解决的问题。

1.5 高通量筛选技术

高通量筛选应用多种药物作用靶点对大量化合物进行高速、高效、低成本、微量化的筛选，最大限度地发现药物。它将化学、基因组研究、分子生物学以及自动化仪器等先进技术有机组合成一个高程序、高自动化的新模式，从而创造了发现新药的新程序。

药物必须通过多种生物膜才能到达靶区，药物的细胞内活性要求其必须通透目标细胞的生物膜才能起作用。当前，从考察药物膜通透性来进行活性分析，是筛选组合化学库和中药天然成分库的一个新亮点。朱深银等[14]建立了黄嘌呤氧化酶活性的紫外检测法及其抑制剂体外高通量筛选模型，通过对筛选条件优化，建立了可靠的筛选模型，并对71 760种样品进行了初筛，发现27个活性化合物，命中率为0.038%，其中有17个有较好量-效关系。张丹参等[15]通过对建立的谷胱甘肽转移酶（GST）抑制剂的高通量筛选模型，对不同来源的31 098个化合物样品进行高通量筛选。通过初筛和复筛，从中发现了4个有较强抑制活性的样品。该模型适合于大规模的高通量筛选，平均日筛选量可达15 000样次以上，为寻找新的GST抑制剂提供了一种先进的技术手段。

2 中药复方物质基础研究的理论体系

2.1 天然组合化学库和多靶点作用机制

周俊院士提出的天然组合化学库的思想和中药多靶点作用的机制，为我们研究复方提供了理论依据。他认为中药复方是一个天然组合化学库，是根据中医理论和实践以及单味药的功能主治性味，通过人工组合形成的具有疗效且相对安全的天然组合化学库。这种“天然组合化学库”具有两个基本特点：①含有几种或某群有效或有生物活性的化学成分；②所含的化学成分是多类型的，可能含有酚类、生物碱、萜类、甾体和配糖体等，是一个多样化的库。我们要做的是找到某种分离手段从中药及其复方中获取“天然组合化学库”。中药药效物质基础的生物活性筛选/化学在线分析方法[16]，能够使有效成分的分离与筛选相结合，克服以往先从中药中分离单体或有效部位，再分析其药效，致使成分分离与效应筛选脱节的弊端，有助于阐明中药多成分、多靶点的作用特点。

无机陶瓷膜分离技术进行药效物质基础研究时，依据中药有效成分的分子量特征，对中药及其复方进行“集群筛选”，既符合中医药理论的核心“整体观念”，又与当今药学学科前沿“天然组合化学库”研究思路不谋而合[17]。鉴于开展这种“天然组合化学库”所发挥的“多靶作用”研究的复杂性，由药理模型来筛选“天然组合化学库”必将是十分艰巨而遥远的历程。

2.2 系统生物学和整合化学物质组学的整体系统生物学

2.2.1 系统生物学：系统生物学是继基因组学、蛋白质组学等组学提出之后，首次在分子生物学的知识框架下，从整体层次上研究生命系统的一门新兴科学[18]。系统生物学认为生物系统具有“整体、动态、层次、整合”的特点，通过生物体内不同网络之间的信息传递和整合，使基因或蛋白质产生出最终的生物学功能。它在以往分子生物学提供的大量基因、蛋白质等系统构成信息的基础上将单个生物分子放在整体中加以研究，并以了解整体层次的功能为最终目的。

中医药理论的特色之一就是整体性，而且中药在与人体作用时其活性成分与靶系统之间发挥着强大的系统与系统的作用，这种整体性思想和用药规律与系统生物学具有相通性，会促使中医药学在其自身发展中借助系统生物学这门现代生物学的语言、手段和成果去阐述和进行理论创新[19]。

2.2.2 整合化学物质组学的整体系统生物学：罗国安等[20]以中医药学和系统生物学为基础，建立一个整合化学物质组学的整体系统生物学体系，用于研究外部干预系统（中药复方）与生物应答系统（人体复杂系统）之间“系统-系统”的相互作用。整合化学物质组学的整体系统生物学提供了一个中医药学与现代科学交流融合的平台，有助于全面、系统、深刻的揭示中医方剂的药效物质基础和作用机制，阐明中药复方的配伍规律，指导复方新药研发，更好地传承和发展中医药理论。

3 结语

中药复方十分复杂，使其药效物质基础的研究比较困难，表现在：（1）中药复方的有效成分是一个复杂的多成分组合，即多种成分共同发挥作用；（2）中药复方有效成分可能是中药原药材中不存在的物质，在复方煎制过程中通过多种成分相互作用产生，也可能是药物进入体内后，经过体内代谢产生的；（3）有些有效成分可能是间接途径发挥作用，在脱离机体整体后单独成分可能不能表现出应有的作用；（4）有些成分的作用可能是我们目前尚未认识的，对这些成分，在研究中可能被忽视。因此，中药复方物质基础的研究要从传统的思路和方法中走出，不断引入新的理论、思路、方法和技术。现在很多相关学科的研究成果被应用到此领域中来，将中药复方多成分、多靶点、多途径的作用特点与基因、蛋白表达关联起来进行高通量筛选。血清药理学与血清药物化学、药动学、生物膜色谱、指纹图谱、生物芯片、高通量筛选等技术整合到中药复方的研究中，具有广阔的发展前景。这些方法和技术的综合运用，可能会在中药复方效应物质基础研究方面取得重大突破，从而对阐明与发展中医药理论，阐释复方制剂化学成分变化规律产生深远影响；并为创制现代新型中药、提高中药质控水平、实现中药现代化奠定坚实基础。

[1]曹 宜，董自波，朱 荃.茵陈蒿汤提取物保肝作用的血清药理学研究[J].甘肃中医，2003，16（7）：44.

[2]窦志华，丁安伟，王陆军，等.复方五仁醇胶囊血清药物化学研究[J].中草药，2006，37（8）：1 137.

[3]王喜军，丁 岗，崔 瑛，等.地黄血清药物化学的初步研究[J].中国天然药物，2003，1（2）：85.

[4]曾俊芬，宋金春，鲁建武.生化汤药动学及其血清指纹图谱研究[J].中国药房，2008，19（9）：650.

[5]Beigi F，YangQ，Lundahl P.Immobilized-liposome chromatographic analysis of drug partitioning into lipid bilayers[J].J Chromatogr A，1995，704（2）：315.

[6]毛希琴，孔 亮，汪海林，等.生物膜色谱及其在药物活性成分分析中的应用[J].分析化学，2002，30（2）：231.

[7]齐炼文，李 萍，盛亮洪.透析-高效液相色谱法在当归补血汤药效物质基础研究中的应用[J].分析化学研究报告，2006，34（2）：196.

[8]毛希琴，邹汉法，罗权州，等.模拟生物膜色谱用于预测药物的小肠吸收[J].分析化学，2001，29（10）：1 135.

[9]董倩倩，李 萍，闻晓东.丹参成分在Caco-2细胞中吸收的研究[J].中国天然药物，2007，5（1）：59.

[10]Boyer J，Brown D，Liu RH.In vitro digestion and lactase treatment influence uptake of quercetin and quercetin glucoside by the Caco-2 cell monolayer[J].Nutr J，2005，4：1.

[11]杨东风，梁宗锁.中药指纹图谱研究进展[J].中国药房，2007，18（6）：467.

[12]梁生旺，崔永霞，王淑美.金银花的HPLC药效指纹图谱研究[J].中草药，2006，37（10）：1 489.

[13]李 康，宋粉云，李焕丹，等.减味藿香正气水药效物质基础的研究[J].广东药学院学报，2007，23（3）：234.

[14]朱深银，周远大，刘庆山，等.黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用[J].中国药学杂志，2007，42（3）：187.

[15]张丹参，张天泰，李韶菁，等.谷胱甘肽转移酶抑制剂的高通量筛选[J].药学学报，2008，43（1）：108.

[16]吴 茜，毕志明，李 萍，等.基于整体观的中药药效物质基础的生物活性筛选/化学在线分析研究新进展[J].中国药科大学学报，2007，38（4）：289.

[17]郭立玮.无机陶瓷膜分离技术对中药药效物质基础研究的意义[J].膜科学与技术，2002，22（4）：46.

[18]Kitano H.Foundations of systems biology，chapter systems biology：toward system-level understanding of biological systems[M].MIT Press：Cambridge/MA，2001：1.

[19]张继勇，王国庆，王 钊.系统生物学与中药现代化[J].中国中药杂志，2005，30（22）：1 725.

[20]罗国安，梁琼麟，刘清飞，等.整合化学物质组学的整体系统生物学[J].世界科学技术-中医药现代化，2007，9（1）：10.