结核病动物模型研究进展

袁 伟，秦 川

(中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)

结核病动物模型研究进展

袁 伟，秦 川

(中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，是危害人类健康的主要传染病之一。动物模型已经成为研究人类传染病的标准化工具。虽然对于结核分枝杆菌而言并没有真正意义的动物资源，但由于不同种类的动物，对分枝杆菌的敏感性不一样，因此可以成为结核病研究的有利工具。结核病最常用的实验动物模型包括小鼠、兔和豚鼠。每种动物有其自身特点，但并不能完全模拟人类疾病。通过建立结核病的动物模型，可以大大增加我们对疾病的病因、毒力和发病机制的理解。除了这三种模型外，非人灵长类也常被用于结核病的研究。本文总结了这几种结核病模型的研究状况。

结核病;模型，动物

结核病是一种传染性疾病，它可以通过空气传播;只有肺结核患者才具有传染性;每个传染性肺结核患者，平均每人每年可以传染10～15人;每一秒钟全球都会有人感染结核菌;据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌，也就是20亿人口感染了结核菌。全球有活动性肺结核病人约2000万，每年新发结核病人约800～1000万，每年约有300万人死于结核病［1］。卫生服务体系的不力，艾滋病和耐药结核的传播加剧了结核病对人类的威胁。据估计［2］，如果不能有效控制结核病:2000年到2020年间，将有10亿人感染结核菌，2亿人将发展为结核病，3500万人将死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。

卡介苗(BCG)是法国科学家Camille Guerin和Charles Calmette在上个世纪第一个10年中开发出来的，1921年开始应用于人类，迄今已使用了80多年。在世届卫生组织免疫接种扩大方案中，卡介苗作为目前唯一的结核病疫苗正在广泛使用。接种后可预防儿童发生结核病，特别是能防止那些严重类型的结核病，如结核性脑膜炎。虽然所有可获得疫苗免疫资料的Meta分析可产生50%的理论性保护率，但据估计卡介苗仅能预防因结核病导致所有死亡的5%。因此，抗结核病的新药与新型疫苗的研发迫在眉睫。然而，药物疗效分析、疫苗效果评价等都离不开结核病的实验动物模型。

1 小鼠的结核病模型

结核杆菌的发现者罗伯特科赫第一次使用小鼠作为实验模型，他发现接种结核分枝杆菌的小鼠能诱导出与人病变一样的自然过程。在上世纪40年代，当第一个有效治疗结核的化疗药正在开发之时，许多研究者认识到了小鼠作为新药成本效益评价模型的重要性。McKee等认为，用小鼠模型衡量药物有效性比其他动物模型更为准确。在Dubos和Pierce的一系列实验中，给以若干卡介苗亚株免疫的小鼠对结核有抵抗性［3］。Collins 和 Mackaness［4］在预防免疫和结核敏感性之间建立起联系;而Lefford［5］建立了小鼠过继性免疫的模型。

结核分枝杆菌在小鼠体内生长情况已经被详细的描述，即感染在靶器官呈现出特征性分布。通常采用静脉内注射和气溶胶方式感染动物。结核分枝杆菌的感染过程和感染速度主要通过以下几个因素来调节:

① 细菌的毒力:这包括诸多方面，但脂质是最为关心的，因为它们能通过感染巨噬细胞而诱导细胞因子的产生，并且影响其清除氧自由基的能力。

②细菌存在的脏器:肝脏中细菌的繁殖速度赶不上脾脏，它们也会感染肺脏和肾脏组织中的吞噬细胞。这些细菌仅仅在免疫活性的小鼠体内生长，但是最终都会形成脓肿。

③接种剂量:能够启动小鼠体内获得免疫反应前的延迟时间与接种剂量成相反的关系。

④免疫反应的强度:不同品系的小鼠对结核杆菌的自然抵抗能力不同。如 CBA、DBA/2、C3H、和129/SvJ近交系小鼠高度敏感，而 BALB/c和C57BL/6小鼠高度抵抗。在一些小鼠品系中，牛型结核杆菌在肺脏中的繁殖程度不如人型。但是牛型(Ravenel)比人型(H37Rv)更容易杀死小鼠。

小鼠几乎没有迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)，通过气溶胶或肠外途径感染结核杆菌并不能形成真正的干酪样坏死，但可以引起T细胞介导的免疫反应。与其他动物相比，小鼠之所以被广泛使用是因为价格低廉、种群数量庞大、遗传背景清楚、免疫系统研究比较透彻、针对小鼠细胞因子及免疫细胞的试剂及抗体供应充足［6］。已经有学者在人和小鼠的初始免疫反应间发现了相似之处［7］。例如，小鼠的巨噬细胞使用其表面的Toll样受体来识别分枝杆菌抗原并诱导细胞因子的产生，而后者对肉芽肿的形成是至关重要的［8］。小鼠感染结核后肉芽肿形成的过程与人类和其他易感动物(如豚鼠)并不相同，主要是因为产生初始抵抗和强烈的细胞反应，进而控制了细菌的增殖和疾病的进展［9］。由于小鼠并不能形成明显的干酪样坏死，因此它们的肺损伤不能发展为空洞。

结核免疫主要是T细胞介导的，不能产生T细胞的裸鼠和严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠成为人们感兴趣的动物模型。裸鼠无毛且胸腺发育不全，由于其不能产生功能性T细胞，因此不能抵抗结核和其他分枝杆菌的感染。联合免疫缺陷小鼠由于缺乏T细胞和B细胞，与裸鼠一样也不能抵抗结核和其他分枝杆菌的感染。这两类小鼠模型常用于分离细胞群抵御分枝杆菌感染能力的检测。去胸腺(thymectomized，TXB)小鼠是另一种动物模型:在4周大时，小鼠胸腺被移除。经一周的恢复，小鼠被暴露于能杀死所有的分裂细胞，包括骨髓细胞的电离辐射下。由于T细胞缺陷，去胸腺小鼠对静脉途径感染的结核杆菌几乎没有抵抗力。另一种免疫缺陷形式是由于衰老而出现的免疫反应下降。研究发现，亚致死剂量(105)的结核杆菌静脉感染青年小鼠后，小鼠可以抑制并控制感染;但同样剂量对于24～48月龄的小鼠来说却是致命的。

应用小鼠模型进行结核病研究有很多优点。和人类一样，小鼠能产生强烈的免疫反应。一般来讲，它们能抵制低剂量的感染并能抑制感染而不发展为活动播散性疾病。而且，它们同人类一样，当衰老时感染很可能再次复发。但小鼠比人更能耐受结核杆菌的感染，疾病过程和病理改变明显不同于人的结核病，小鼠的肉芽肿很难发展为干酪样坏死和液化，而这些病理变化过程在结核患者中经常发生。

2 豚鼠的结核病模型

在19世纪和20世纪，豚鼠是最为广泛使用的用于感染性疾病研究的实验动物。豚鼠和人类有许多相似之处。这些相似点对人们应用豚鼠作为感染性疾病模型产生了直接或间接的影响。其主要相似点在于:①像新生儿一样，新生豚鼠拥有非常成熟的淋巴髓细胞样复合体;②与啮齿动物相比，其激素水平和免疫状态更接近人类;③与人类一样，豚鼠需要外源供给维生素C;④像人和非人灵长类动物一样，豚鼠具有糖皮质激素抵抗性;⑤豚鼠呼吸道生理与人惊人的相似，特别是肺部对炎症刺激的反应。

豚鼠在生物制剂和抗结核药物测试的实验中被广泛使用。它已经成为判断人类皮肤结核菌素效能试验和生物制品检定的金标准。同样，卡介苗的发明者Camille Guerin和Charles Calmette就是主要使用豚鼠进行临床前期测试的。豚鼠对抗结核药物反应良好，该模型已经成功应用于新药和联合用药的测试。由于大量耐药菌株的出现，豚鼠将成为新药开发和抗结核药物效果评定的主要模型［10］。

在过去的50多年中，豚鼠模型在帮助我们理解结核杆菌和宿主人之间关系上起了重大作用。在早期关于结核的豚鼠实验模型研究表明，以往分枝杆菌的接触经常会引起迟发超敏反应和结核杆菌组织聚集的增加。随后，许多学者致力于营养不良与结核抵抗力关系的研究［11］。其它关于结核杆菌与宿主吞噬细胞及分枝杆菌成分毒力潜在作用的研究也使用了豚鼠模型。

就疫苗发展而言，减少或阻止组织损伤是一重要的原则，而应用豚鼠模型就很容易做到这一点。由于豚鼠能发展成与人一样经典的肉芽肿而使得它们很奇特，即它们能呈现出 Langhans多核巨细胞，一种因巨噬细胞融合而产生且在人类肉芽肿中非常常见［12］。疫苗接种对于豚鼠的肺结核演进过程有重要的影响。许多疫苗在豚鼠身上都测试过，包括无活性杆菌、减毒杆菌、卡介苗的不同菌株、重组蛋白疫苗和DNA疫苗等。Jespersen认为通过皮下或皮内注射接种较低剂量的卡介苗都是十分有效的。Palendira等推断，卡介苗的保护作用并不依赖其接种途径。进而，Lagranderie等认为通过气溶胶方式接种卡介苗与肠外方式的免疫效果相当。

除了原发性肺结核外，豚鼠模型还被广泛用于诸如结核性胸膜炎、外源性再感染、内源性复燃等研究。气管内注射活卡介苗或者热灭菌的结核杆菌能诱导豚鼠的胸膜炎。将有毒性的结核分枝杆菌通过呼吸道途径对已经感染过非结核分枝杆菌的豚鼠进行再次感染后，并未发现疾病的加重，而是像人类一样，提供了保护作用。内源性复燃的结核病常发生在老年人群，内源性复燃的疾病模型将帮助我们理解结核杆菌在组织中长期存在的因素以及与之相联系的休眠杆菌的激活和大量增殖等事件。目前，关于豚鼠内源性复燃的资料比较有限。

豚鼠被认为是到目前为止非常好的结核病模型动物。它感染结核杆菌后造成大量组织损伤，导致广泛的干酪化和组织坏死，发生钙化或空洞，临床表现为呼吸微弱、体重骤减，感染8～20周后死亡，与人体感染结核杆菌在肺中造成的损伤相似，因而比较好的复制了人体感染结核杆菌的病变过程。但就研究宿主的免疫反应而言，豚鼠模型相对滞后于其他动物模型，主要限制在于缺乏特异性免疫试剂。近年来，人们一直致力于豚鼠细胞因子和趋化因子的基因克隆、细胞因子和趋化因子的重组表达及豚鼠感染结核后相关免疫试剂的研发［13］。例如，研究者发现通过使用豚鼠单克隆抗体，在低剂量气溶胶感染后可以肺部出现大量免疫细胞的集聚［14］。

3 兔的结核病模型

对于兔的结核病而言，主要是肺组织的破坏，即宿主对细菌抗原自身反应的结果。Dannenberg和Lurie通过使用兔的实验模型对结核病进行了最为广泛的研究。近交系兔子被用来研究结核的抵抗性和易感性。抵抗性兔子当感染具有毒力的牛型结核杆菌时会发展成与人相似的空洞型肺结核。易感性兔子或免疫低下的个体则像新生儿一样发展成血行播散型肺结核。绝大多数商业化供给的兔子对结核杆菌都有抵抗性。因此，当感染具有毒力的牛型结核杆菌时，大多数兔子都会发展为空洞，而极少死于该病早期的血行播散。因为一般来讲兔子并非近交，所以它们对结核杆菌的抵抗性存在很多变异。

兔的肺结核像人一样有5个阶段:①肺泡巨噬细胞吞噬吸入的结核杆菌;②细菌在未激活的吞噬细胞中生长;③迟发型超敏反应杀死了胞浆中聚集大量结核杆菌的巨噬细胞;④分为2种情况:在近交系抵抗性兔中，细菌从干酪样中心边缘逃出并在低活性巨噬细胞内生长;或细菌从干酪样中心边缘逃出并不能在高活性巨噬细胞内生长。⑤结核的固态干酪中心液化，细菌在细胞外大量繁殖，最终空洞形成。

Dorman等［15］通过气溶胶途径用 Erdman或H37Rv株结核杆菌分别感染近交系和非近交系新西兰白兔并进行比较。感染后5周，近交系兔比非近交系兔有更大的肺结核灶。用H37Rv株结核杆菌感染后，近交系兔比非近交系有更多的肺结核灶且每个灶中分枝杆菌的集落形成单位也较多。将二者进行组织学比较发现，近交系兔有更多的干酪样坏死，更多的活菌数量和极少的上皮细胞。因此，认为近交系兔比非近交系兔对结核更敏感。

因为兔能够复制出人类结核病的许多特殊阶段，所以它也成为了研究结核的良好动物模型之一。兔感染结核杆菌后肺部形成的肉芽肿常可发展为液化，易形成结核空洞，是目前可用于空洞研究的最重要动物之一。感染结核杆菌的兔发生的皮肤超敏反应可以精确地复制出人体感染后的皮肤反应，这些都显示出兔结核动物模型的优越性。但是，兔模型的发展正遭遇诸如相关免疫制剂的缺乏、购买成本的提高和必须在生物安全3级动物实验室内饲养等条件的制约。

4 非人灵长类结核病模型

小鼠、豚鼠和兔的结核病模型各有各的优势，但都不是最理想的模型。作为结核病机制研究是可行的，但由于它们和人的生理、免疫系统的差距，使得它们作为结核病的动物模型先天不足，尤其在新的结核疫苗的安全性及有效性评价中，这种差距显得更为突出。非人灵长类具有与人相类似的生理特征，对结核分枝杆菌易感，能通过与人相似的感染途径、感染方式和感染剂量等，发展成类似人的疾病特征。

Walsh等［16］报道，菲律宾食蟹猴比猕猴更能抵抗人型毒菌株的感染。通过气管途径给予10～100细菌量的感染，发现食蟹猴可发展成慢性演进的肉芽肿性疾病。结核菌素皮试有变化，但是未形成空洞。虽然食蟹猴表现出比猕猴更强的抵抗性，但是仍然与人的抵抗性不同。Langermans等［17］比较了卡介苗的免疫效果以及在猕猴和食蟹猴中的感染过程。他们发现，未受免疫的猕猴和食蟹猴表现出C反应蛋白的升高、结核特异性IgG抗体的升高和广泛的空洞与干酪样坏死形成。卡介苗几乎完全阻止了食蟹猴病理过程的发生，且与未免疫的猴子相比，肺部活菌数量呈对数减少。但是，猕猴并不能受到卡介苗的有效保护，因为应用卡介苗免疫的猕猴出现了结核病的病变过程。最近，日本学者Sugawara［18］报道了受结核感染的猕猴，应用重组卡介苗(rBCG-Ag85A)比传统的卡介苗(BCG)诱导了更好的保护效果。这使得研究者们应用非人灵长类模型进行疫苗评价产生了巨大的兴趣［19］。

DTH在非人灵长类的皮肤反应很弱。自然感染结核杆菌后，猴子的皮试阳性率很低。而使用旧结核菌素试验，绝大多数猴子眼睑会出现 DTH，但一些猴子仍然会保持皮试阴性［20］。非人灵长类结核肉芽肿的组织病理学与人类相似，病灶中央为干酪样坏死，坏死灶周围可见大量类上皮细胞和Langhans巨细胞。而且在形成空洞的猴子中，空洞的尺寸大小不一。坏死的大空洞可浸润到气道，伴有结核性肺炎的出现。因为非人灵长类并非近交，其病理改变多种多样且不可预测。所以，尽管人们认识到非人灵长类中空洞的发生，但在该模型中有关空洞的系统研究仍未开展。

非人灵长类与人类的遗传物质有75～98%的同源性，在生理、形态和机能上与人类十分接近，显出了诸多与人类相似的生物学和行为学特征，成为解决人类健康和疾病问题基础研究及临床前研究的最理想的动物模型。

5 结语

结核动物模型在阐明结核分枝杆菌毒力基因、细菌在宿主内持续存活的机理以及新型药物、疫苗、诊断试剂评价方面起着重要的作用。但是，各种实验模型都有其适用范围，这就要求在实验设计时选取最佳实验模型，以取得最科学的实验结果。随着对结核病研究的深入，各种检测试剂的开发，各种新的试验技术的应用，实验模型在结核分枝杆菌的研究中将会发挥更大的作用。

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Advance in Animal Model of Tuberculosis

YUAN Wei，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China)

Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis infection，which is one of the main infectious diseases that are harmful to human health.Animal models have become standard tools for the study of a wide array of human infectious diseases.Although there are no true animal reservoirs for Mycobacterium tuberculosis，many different animal species are susceptible to infection with this organism and have served as valuable tools for the study of tuberculosis.The most commonly used experimental animal models of tuberculosis are mouse，rabbit and guinea pigs.Each model has its own merits for studying human tuberculosis，and none completely mimics the human disease.The studies of TB in laboratory animals have significantly increased our understanding of the etiology，virulence and pathogenesis of disease.In addition to these three species，tuberculosis research has occasionally involved nonhuman primates.This review summarizes several important research model of tuberculosis.

Tuberculosis;Model，animal

R521

A

1671-7856(2010)09-0055-05

2009-12-21

袁伟(1977－)，博士生。E-mail:docyw@sohu.com。

秦川，教授，博士生导师。E-mail:chuanqin@vip.sina.com。