肿瘤血管生成中VEGF/VEGFRs的分子影像进展

邱龙华 冯晓源

血管生成(angiogenesis)在各种正常和病理组织生长过程中具有关键的调制作用,而对于实体肿瘤的生长和转移等生物学行为尤为重要。因此,近来抗血管生成治疗也成为肿瘤治疗的一种新兴、有效的手段和方法。鉴于此,对于新生血管生成过程进行影像学评价便具有非常重要的临床意义和应用价值[1-3]。

目前,肿瘤血管成像可分为间接成像和直接成像两类[3]。间接成像技术(如CT灌注、MRI灌注、微球造影彩色Dopp ler超声、PET脑血流灌注成像等)主要通过提供组织血流量、血容量和血管通透性等信息,反映血管的组织和功能特征,并已较多应用于临床诊断和研究中[3-7]。但是,间接成像技术不能真实反映血管、尤其是肿瘤血管生成的实际情况,所提供的主要是血管的某些功能性特征,缺乏量化指标,不能早期诊断肿瘤,因此具有一定的局限性。

直接成像通过将某些靶向造影剂血管内注射,使之与血管内表达的蛋白质特异性结合,达到血管显影的作用[3]。目前,直接成像主要归于分子影像学的范畴。肿瘤血管生成过程中,某些蛋白质分子表达上调,利用相应的配体(如肽类、蛋白质和抗体等),以影像标记物质(如放射性核素、超声微球、荧光染料、顺磁性颗粒等)标记后作为示踪剂(tracer),与这些特定的靶向分子结合,就可以进行PET、超声、光学及MRI血管成像[8]。本文主要对血管内皮生长因子/受体(vascular endothelial grow th factor/VEGF receptors,VEGF/VEGFRs)在分子成像中的应用及进展进行综述。

血管内皮生长因子/受体(VEGF/VEGFRs)

血管内皮生长因子/受体(VEGF/VEGFRs)信号通路在正常血管形成和某些病变(如肿瘤)血管生成过程中具有重要作用[8-11]。VEGF家族包括多种同源蛋白:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子,各种VEGF蛋白具有相似的生物学作用,其中VEGF-A在血管生成过程中最为重要。VEGF-A包括VEGF 121、VEGF 165和VEGF189等五种亚型,不同亚型间生物学性质各有不同。VEGFs可以与三种特异性的受体(VEGFRs)结合:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,前两者主要在血管内皮细胞和造血细胞表面表达,后者表达于淋巴管内皮细胞。VEGFR与相应VEGF结合后均可表现为酪氨酸蛋白激酶活性,介导信号的传导过程[9]。

多项临床研究显示,肿瘤预后与VEGF表达呈相关性,高表达肿瘤往往预后更差。目前,临床已应用抗VEGF-A的单克隆抗体药物(Bevacizum ab,贝伐单抗)进行肿瘤的抗血管治疗,其机制是阻断VEGF在肿瘤血管生成过程中的调节作用。因此对VEGF/VEGFR进行靶向分子显像,能对抗肿瘤血管生成治疗疗效进行评价,提高肿瘤治疗的合理性和针对性。

SPECT和PET显像

SPECT较PET更早应用于VEGF/VEGFRs分子成像。但是与SPECT相比,PET成像具有更高的敏感性,PET/CT使得图像分辨率得到提高,临床应用更为直接、便利和广泛。常用的放射性核素有123I,111In,99mTc和64Cu等。

对于循环或肿瘤VEGF分子表达水平的测定分级,有助于描述肿瘤血管生成的生物学属性,判断肿瘤的侵袭性和预后[12,13],指导抗血管药物治疗策略的制定。Stollm an等[14]及 Nagengast等[15]研究利用核素标记VEGF单克隆抗体Bevacizumab制备相应探针,进行肿瘤SPECT或PET成像。注射探针后一天之内,探针主要存在于血流灌注大的器官及血浆中,之后逐渐清除,3天时肿瘤摄取明显增高,肿瘤/非肿瘤摄取比增高,7天时相对摄取比达到峰值。竞争性拮抗实验或核素标记非特异性抗体成像均提示:肿瘤对于Bevacizumab抗体探针的摄取是VEGF-A特异性介导的,而非血管灌注或被动弥散等因素引起。目前对于VEGF的核素成像主要集中于对VEGF抗体探针体内分布及清除进行研究[14-16],而VEGF表达在抗肿瘤治疗前后的变化及其作用意义还未有相关研究报道。

由于VEGF与其受体间具有天然的、高亲和、高特异的结合能力,因此目前研究均使用核素标记的各种VEGF亚型作为配体对VEGFRs进行相应的靶向成像。VEGF-A亚型VEGF121及VEGF 165的应用最多。123I标记的VEGF121和VEGF 165已应用于人胃肠道、胰腺等多种肿瘤核素成像,并对探针体内分布、肿瘤摄取率及清除等进行分析[17,18]。

Yoshimoto等[19]研究显示,123I-VEGF 121在人LS180结直肠肿瘤中的摄取高于123I-VEGF165,而清除速度明显慢于后者。同时,这两种探针在同一或不同组织内的分布、摄取均有较大差别,其可能机制在于:VEGF121、VEGF165对于VEGFR-1(flt-1)及VEGFR-2(KDR)的亲和性不同,而不同组织血管内皮细胞表达VEGFR-1和VEGFR-2又具有差异性。该研究还显示,肿瘤内的123I-VEGF121摄取率随肿瘤增大而减低,提示VEGFR的表达可能与肿瘤大小具有一定相关性,较小的肿瘤表达高于较大的肿瘤。Cai等[20]的研究也有类似结果。利用64Cu标记的VEGF121对人 U87MG胶质瘤VEGFR表达进行PET成像,64Cu-DOTA-VEGF121能快速、特异性和显著的被体积较小的U87MG肿瘤摄取,注射23h内,肿瘤摄取率大于14.9%ID/g。而体积较大的U 87MG肿瘤摄取率明显较低,仅肿瘤周边散在摄取,摄取率低于3%～4%ID/g。肿瘤摄取率与大小间的关系通过免疫荧光技术获得证实,体积较小的肿瘤VEGFR-2的表达明显高于较大体积肿瘤。利用非侵入性的影像学方法,研究不同类型、不同大小肿瘤VEGFR表达水平的差异性,有利于指导临床决定是否、或者何时进行抗血管治疗,以提高肿瘤治疗的有效性。

研究发现,在肿瘤血管生成及肿瘤演进过程中,VEGFR-2的作用较VEGFR-1更为重要。如前所述,目前大多数基于VEGF-A为配体的VEGFR分子探针均可同时与VEGFR-1和VEGFR-2结合。由于肾脏等器官中可表达高水平的VEGFR-1,肾脏对于这些探针药物的摄取累积较高,这会导致肾脏药物代谢负担和肾毒性的增加[11,21]。因此近来有学者对VEGFR-2特异性的VEGFR显像进行研究[21]。研究人员通过DNA重组技术合成了VEGF 121的变异体VEGFDEE,与VEGF121相比,VEGFDEE与VEGFR-1亲和性降低20倍,而与VEGFR-2的亲和性无明显减低。64Cu-DOTA-VEGFDEE肾脏摄取显著低于64Cu-DOTA-VEGF121,从而降低了肾毒性,有利于药物探针的临床应用。

超声成像

对于VEGF/VEGFRs超声成像的报道较少。最近的一项研究[22]应用特异性鼠VEGFR-2单克隆抗体标记的超声微球,对鼠SVR血管肉瘤及C 6胶质瘤模型进行成像。注射探针微球后,两种肿瘤的超声信号均明显增强,竞争性阻断后(应用过量VEGFR-2单克隆抗体拮抗),肿瘤信号明显降低。用免疫球蛋白标记的对照微球,仅由于较弱的非特异性结合引起肿瘤信号轻度增加。

Korpanty等[23]和Palmow ski等研究[24]对肿瘤治疗前后VEGFR-2表达进行超声成像定量分析。荷人胰腺癌和鳞癌裸鼠化疗前后,注射VEGFR-2抗体结合微球,超声定量测定肿瘤内微球浓度。结果均显示,治疗组肿瘤内与VEGFR-2特异性结合的微球浓度明显减低,超声信号减低,尤其在肿瘤周边部,超声信号减低更为显著,而对照组浓度显著升高。免疫组化结果也证实,治疗组VEGFR-2染色阳性分数及CD 31微血管密度等均显著低于对照组。因此,对于VEGFR-2表达进行测定,可以用于对治疗疗效进行评价监测,指导临床合理用药。

以上的实验均表明,VEGFR-2单克隆抗体标记的微球,能特异性的和肿瘤血管内皮VEGFR-2结合,用于血管VEGFR-2表达的定量分析、监测肿瘤血管治疗疗效。

光学成像

常用的光学成像技术有荧光成像和生物发光成像。光学成像具有多功能、高敏感性、成像过程相对简单等特点,尽管受到空间分辨率和组织探测深度等限制,目前还是较多地应用于小型实验动物的全身成像研究中[25,26],而近红外光学成像在荷肿瘤动物光学成像中应用较广泛。

有研究[27]采用单链VEGF与花青染料Cy5.5结合制备光学显像剂scVEGF/Cy,对鼠4T1和人MDA-MB-231乳腺肿瘤进行近红外成像。研究首先采用生物发光成像技术 (BLI)确定肿瘤边界,行scVEGF/Cy荧光成像后,可见BLI确定的肿瘤范围内选择性的荧光探针摄取作用。而对VEGF/Cy进行灭活或预先行scVEGF竞争拮抗,则探针药物的摄取明显受抑制,成像信号减弱。以上结果也证实成像过程中VEGF受体结合的重要作用。

多项研究显示,放疗、化疗或光敏感疗法(PDT)等抗肿瘤治疗会引起肿瘤VEGF表达上调,导致肿瘤生长、转移等侵袭性增高[28]。Chang等[29]利用抗VEGF抗体结合荧光染料制备相应探针 (CAVEGF)进行光学成像,与不同肿瘤血管VEGF特异性结合后测定荧光信号,显示了与体外定量ELISA结果间良好的相关性。行PDT治疗后1h,各种肿瘤荧光信号即有明显增高,24h后经ELISA证实,肿瘤VEGF浓度较治疗前增加2倍以上。临床上,针对放化疗后VEGF表达上调的患者,增加抗血管治疗,可以提高疗效,降低复发、转移的可能性。因此在治疗中对VEGF表达水平进行监测就具有了重要的临床应用价值和意义。

MRI成像

目前,磁共振技术(MRI)对VEGF/VEGFRs进行直接成像尚未有相关报道。一些研究利用动态增强MRI(DCE-MRI)对肿瘤血管通透性等进行分析,研究其与肿瘤VEGF表达的相关性[30],也有研究利用MRI解剖成像功能对其他分子影像技术相应结果进行验证[31]。但MRI已用于对体内其他蛋白(如整合素αvβ3)进行分子成像[32,33],并显示了较好的应用价值。MRI与其他分子影像技术相比,具有更高的空间和时间分辨率,无放射性损伤等优势。但是MRI对体内生物信号探测的敏感性却较低,曾限制了该技术在分子影像中的应用。然而随着纳米材料的不断研发和应用,这一限制被逐步突破。纳米颗粒具有较大的表面积,可以携带大量的钆剂或UPIO颗粒,从而极大地提高了生物信号,有利于MRI的探测[34]。相信基于MRI技术的VEGF/VEGFRs分子成像会较快应用于基础和临床研究。

分子成像展望

由于各种分子成像技术均有一定的局限,单一应用某种技术进行成像往往不能获得全面准确的信息。近来,多模式的分子成像成为研究的重点。采用多模式进行成像,通过引入单一探针造影剂,可以同时完成两种或更多的成像过程,使得各种技术所得到的结果具有可比性、参照性,同时充分结合各种技术优势,获得更为满意的成像效果,提高成像的准确性[2,3,8,34]。

在多模式分子成像过程中,纳米颗粒技术的应用同样至关重要[34]。纳米颗粒可以同时结合多种分子,如靶向结合配体、影像标记物或者治疗性药物等。目前,利用纳米颗粒合成的多功能(如PET/光学,PET/MRI,MRI/光学等)分子成像探针已经应用在某些实验研究中。如最近,有学者合成了基于铁氧 (Iron oxide,IO)纳米颗粒的PET/MRI双功能探针[35]。该双功能探针的制备是通过铁氧纳米颗粒包被聚合天冬氨酸(PASP)提供表面结合部位,并分别与RGD肽及DOPT-64Cu结合,制备成64Cu-DOPT-IO-RGD探针。利用该探针可以对肿瘤内αvβ3同时或分别进行成像,两者结果具有较好的相关性。可以想象,类似的探针同样可以应用于VEGF/VEGFRs的多模式分子成像中。

多模式的成像目前还处于研究初期,对于药物探针在体内代谢、分布、生物兼容性、毒性和靶向结合等生物学性质还有待进一步探索和研究。在不久的将来,非侵入性的多模式成像技术会普遍应用于临床研究中。

肿瘤血管生成成像的意义

肿瘤血管生成成像,尤其是分子成像的发展和临床应用,使得肿瘤的临床前期诊断和治疗成为可能。作为非侵入性的诊断方法,多种影像技术已经应用于基础以及临床研究中,提供了病变探测、药物应用筛选、治疗有效性和监测、疾病预后等多方面的大量重要信息。

VEGF/VEGFRs及其他相关的生物信号分子、蛋白质(如αvβ3,Endoglin-CD105等)在肿瘤血管生成中具有重要的、乃至中枢核心的调节作用。对这些分子进行成像,有助于更好地理解肿瘤血管生成在肿瘤发生发展、演进、转移等过程中的作用。研究显示,肿瘤内VEGF/VEGFRs表达与肿瘤的生物学性质(如生长速度、侵袭性及转移等)相关,应用PET等成像技术,检测其表达水平,可以对肿瘤进行分级,判断其恶性程度,并对预后进行预测。

如前所述,肿瘤在其生长及治疗过程中,血管内皮细胞表面VEGF/VEGFRs表达水平可发生变化,这就对肿瘤药物、放射治疗的实施提出了新的研究课题。肿瘤治疗过程中,应及时调整方案,多种治疗方法同时或序贯进行;肿瘤抗血管治疗也不仅做到个体化,对同一个患者,也存在着治疗时间窗。对VEGF/VEGFRs的表达变化进行分析,可以指导治疗措施的制定,避免不必要、无效的药物治疗导致的药物毒性作用,提高抗血管药物治疗的针对性和时效性,增加放射治疗的方向性。

对于肿瘤治疗前后各种蛋白质表达水平对比检测,还可用于进行治疗效果的评价。同时,目前已有多项研究,在同一纳米颗粒上结合靶向配体、影像标记物和治疗性药物,制备成具有多功能的分子探针。在完成特异性分子结合成像的同时,对肿瘤进行靶向治疗,增加了治疗针对性,降低全身毒性作用,并通过肿瘤对探针药物摄取量的变化等,对疗效进行评价。