单纯疱疹病毒性角膜炎的病原学检测技术进展

张 颖综述，吴欣怡审校

(山东大学齐鲁医院眼科，山东济南250012)

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)主要由 I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV-1)引起，发病率及致盲率均占角膜病的首位。目前HSK的诊断主要依据病史、典型症状和角膜病变形态，但该病临床表现复杂多样，常不典型，与腺病毒、棘阿米巴原虫等引起的角膜炎不易鉴别[1-2]，造成误诊或漏诊，报道误诊率高达79.3%[3]。因此，HSK病原学诊断成为临床确诊的重要依据。病毒培养是HSV-1感染诊断的金标准，但费时费力、技术要求高，难以推广。本文对目前各种检测HSV-1的病原学诊断技术的最新进展综述如下。

1 环媒恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)

是一种新式的恒温核酸扩增方法，由Notomi T[4]于2000年研发。原理为设计4种引物，特异性识别靶基因上6个不同的序列区域，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)扩增靶基因(恒温条件下一小时内可扩增靶基因的109倍)，凝胶电泳检测扩增产物。

1.1 LAMP技术的改进和完善 2001年，Mori Y[5]建立了浊度法-LAMP，改进了检测扩增产物的方法。该法利用扩增副产物-焦磷酸镁白色沉淀的浊度判断靶基因扩增与否，缩短了检测时间，保证扩增与检测同步进行，实现了实时检测监控。2004年，Mori Y[6]依据浊度法-LAMP设计了相应的检测仪器，可在恒温下实时检测多个样品的浊度变化，实现了对多个LAMP扩增产物的定量分析。2002年Nagamine K[7]发现，在LAMP反应体系中加入一种环状引物(loop primer)可加速反应，使实验总时间缩短至30 min内。2007年，Kaneko H[8]评价了LAMP对临床样品中杂质的耐受性，认为可直接检测样品，无需先提取样品中DNA。

1.2 LAMP的优点 ①条件简易，对空间及环境要求较小，无需大型精密仪器和特殊试剂，可适用于各级医院及小型诊所。②过程简单：该法不必进行模板热变性、多个热温循环、繁琐易污染的电泳、紫外观察等PCR反应过程。③反应迅速：四个区域同时环状扩增，形成茎-环结构，可在30 min内扩增至靶基因的109倍。④操作简便：虽然原理较复杂，但仅需将检测样品和试剂一起放入恒温环境中30-60 min，即可肉眼判断扩增与否，无需专业人员。⑤特异性高：4个引物特异性识别靶基因上6个不同的区域，且六个区域的顺序也有规定，因而特异性高。⑥灵敏度高：模板1-10拷贝即可实现扩增。

1.3 LAMP对HSV-1的检测效果 Sugiyama H[9]利用 LAMP和“金标准”病毒培养法检测38例疑似HSV-1感染的生殖器皮损样品。结果显示：与病毒培养相比，LAMP扩增30分钟、60分钟的灵敏度分别为90%(9/10)、100%(10/10)，阳性预测值分别为100%(9/9)、100%(10/10)。提示：①LAMP灵敏度较高，可有效的筛检病人；②阳性预测值高，LAMP结果阳性时患病的可能性较高。该研究样本含量较小，不能显示不同扩增时间下LAMP灵敏度之间的统计学差异，尚需进一步研究确证。

Yoshihiko Enomoto[10]将23例皮肤、口腔粘膜疱疹和生殖器疱疹样品配对设计为是否提取DNA两组，评价LAMP对两组样品中HSV-1的检测效果。与检测速度较快的PCR相比，浊度法LAMP检测效果与PCR相同，样品是否提取DNA对其检测效果无明显影响。Kaneko H[11]利用60例疑似眼部及生殖器疱疹样品，评价LAMP、PCR检测直接样品的效果。结果表明，与“金标准”病毒培养相比，LAMP、PCR检测直接样品的灵敏度分别为 88%(15/17)、6%(1/17)，前者明显高于后者(P＜0.001)。以上研究显示，PCR受临床样品中抑制物(文献报道眼表麻醉剂、荧光素[12])的影响较大；LAMP受临床样品中抑制物的影响较小，可直接检测样品，无需提取DNA，快速且灵敏。浊度法LAMP进一步省略凝胶电泳检测过程，速度更快，达到了快速诊断的目的。

2 PCR技术的改进

2.1 过程的简化 常规PCR需首先提取样品DNA为扩增提供模板，通常认为该步必不可缺，约花费整个PCR检测时间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay，IIF)因参加反应的因素较多，受干扰的可能性大等缺点，限制了其在临床检验诊断中的应用。单克隆抗体(Monoclonal antibody，m-Ab)技术的发展，产生了敏感性高、特异性强的抗体，减少了与其它物质的交叉反应，使试验结果可信度增大，更易于菌种的型及亚型、病毒变异株等的鉴别。随着该技术的商业化，出现了许多单抗试剂盒，进一步加快了检测速度。单克间的一半。Pandori MW[13]用PCR直接检测57个HSV样品，发现无需提取样品DNA，经济省时一半，敏感性下降2-5倍，但相对病毒分离法仍为一种较实用的方法。需强调的是，应用PCR直接检测样品，要求最大化减少样品中的潜在抑制物。Pandori MW[13]发现用擦拭法收集样品经稀释后置于95℃下10分钟，通过稀释组织碎片即可减少潜在抑制物，该条件能充分暴露核酸，提高检测灵敏度。该研究提示，简化后的常规PCR技术节省时间，污染小，值得在临床中推广。

2.2 实时荧光探针定量PCR 实时荧光探针定量PCR，即在PCR反应体系中加入特异性荧光探针(如TaqMan)和引物。该探针能与靶序列特异性结合，探针两端各标记一个荧光报告基团(如FAM)和一个荧光淬灭基团(如TAMRA)。探针完整时，TAMR A淬灭FAM的荧光，致无荧光信号发出；PCR扩增时，具有外切酶活性的TaqMan酶将探针上的FAM切下，FAM与TAMR A分离，产生的荧光信号可被监测。随扩增循环的重复，酶切下的FAM数量增加，实现了荧光信号积累与PCR产物形成的同步进行。Kowalski RP[14]利用该法检测122个角膜或结膜样品中的HSV-1，与病毒培养相比，灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为98%(63/64)、100%(58/58)、100%(58/58)、91%(58/64)，显示了实时荧光探针PCR技术在减少误诊和漏诊方面有优势。与常规PCR相比，该法优点在于，特异度提高，假阳性率降低，更加快速准确，符合临床需要，可成为检测HSV-1的常规手段。

2.3 多重PCR(multiplex PCR) 是在常规PCR技术基础上改进和发展起来的一种新型扩增技术，即在同一PCR反应体系内加入两对或多对特异性引物，一次扩增多个DNA片段，从而实现多种病原体DNA的同时快速鉴定。多重PCR同单引物PCR相比，优点在于多对引物同时扩增，扩增结果的阳性及阴性条带可互为对照，进一步排除了PCR假阳性、假阴性问题，且比多次单引物PCR扩增所用试剂少、时间短、通过一次扩增反应可得到多方面的信息[15]。疱疹类病毒引起的眼部疾病常具有相似的临床表现，特别是发生混合感染，或同时出现多个疑似眼部疱疹病毒感染的患者时，可用该法进行快速诊断，具有临床实际意义。Zhang Y[16]分别利用多重PCR和单引物PCR检测33例疑似眼部疱疹病毒感染的患者，两种方法检出率相同(57.6%，19/33)，因前者可检测出同一样品中的多种病毒，优于后者。 Anne J.Jääskeläinen[17]将多重PCR与生物芯片技术相结合，用于同时检测脑脊液中的八种疱疹病毒，并设计出新的HSV-PCR引物对和寡核苷酸探针，完善了两种技术的结合，提高了检测的敏感性和可靠性。

3 单克隆抗体引导的间接免疫荧光法

隆抗体引导的IIF法，克服了IIF的许多不足，目前得到了广泛的应用。刘军连[18]采用HSV型共同性单克隆抗体为夹心的IIF方法，检测120例生殖器疱疹样品中的HSV，并与病毒培养法进行比较，结果显示：IIF法的灵敏度为96.5%(82/85)，特异性为40.0%(14/35)。IIF法较病毒培养法更适用于病程较长的病例，阳性检出率为83.3%(75/90)，高于病毒培养法的阳性检出率64.4%(58/90，P＜0.01)。作者推断可能原因为：病程较长时，有活力的病毒明显减少甚至消失，但HSV抗原仍存在且能被IIF法检出，所以IIF法优于病毒培养法。Pereira SR[19]分别应用FITC-mAb法、病毒培养法检测感染鼠(BALB/c小鼠)角膜中的HSV抗原，两种方法24小时灵敏度分别为100%(20/20)、45%(9/20)。FITC-mAb法灵敏度明显高于病毒培养法(P＜0.001)。Pereira SR认为单克隆抗体引导的IIF法联合角膜印迹取材法，可直接应用于患者，作为病毒培养确诊前的筛检实验。单克隆抗体引导的IIF法具有较高的诊断价值，但特异性较低，今后仍需更多临床实验综合评价该法，确定该法应用于诊断HSK的临床实用价值。

4 IELIS法

新的HSV-1抗体的出现促使了IELIS技术检测HSV-1的新进展。Idandi K[20]合成了包括全长gG蛋白的pTrc His2A-gG1质粒，并利用该质粒获得了新的HSV-1抗体，联合IELIS法研制出新的型特异性HSV-1诊断试剂盒，灵敏度为100%，特异度为89.5%。

5 小结

早期诊断治疗HSK可降低复发率，诊断延误有可能造成不可逆转的视力损害，因而临床医生应选择快速灵敏的检测方法。目前研究表明，LAMP法、实时荧光探针PCR法能够较快速有效的筛检病人且可信性相对较高，值得普及推广；单克隆抗体引导的IIF法灵敏度较高，但特异性较低，可用作疑似病人进行病毒培养确诊前的筛检实验。目前存在的问题是，尚缺少对各种方法的灵敏度、特异度、阳性和阴性预测值等综合性评价，以便为眼科临床工作者在HSK的诊断和治疗中提供决策证据。

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