siRNA 抑制Survivin基因对大肠癌细胞 HCT116增殖及凋亡的的影响

曹立宇 丁丽红 尹 玉 江 燕 李 昊 张洪福

(1安徽医科大学病理教研室,合肥230032;2温州医学院第一附属医院病理科,浙江,325027)

大肠癌 (colorectal carcinoma,CRC)是人类常见的恶性肿瘤之一,目前主要的治疗方法是手术切除,术后结合放疗及化疗,但多数患者治疗效果不佳,容易复发和转移,死亡率较高。近年来随着对肿瘤发生、发展和转移的分子生物学研究,提出了基因治疗的概念。前期的研究表明凋亡抑制基因Survivin高表达在大肠癌的发生中起重要作用,并与患者预后有关[1]。本研究应用 RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),将针对凋亡抑制蛋白Survivin特异靶点的小干扰RNA (small interferingRNA,siRNA)转染人大肠癌细胞系HCT116,探讨siRNA抑制 Survivin基因后对大肠癌细胞系生物学行为的影响,为进一步以Survivin为靶点的基因治疗提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞来源 人大肠癌细胞株HCT116来源于低分化腺癌,购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体(RAB-0536)及广谱免疫组化S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,β-actin一抗、二抗为博士德生物工程有限公司产品。针对Survivin的siRNA序列由上海闪晶分子生物技术研究所合成,基因序列为:Sense 5’-GGA CCA CCG CAU CUC UAC AdTd-3’,Anti-sense 5’-U GU AGA GAU GCG GU G GUC C dTd-3’。脂质体Lipofectamine 2000为 Invitrogen公司产品,OPTI-MEM培养基、RPMI-1640培养液为 GIBCO公司产品,MTT为美国Sigma公司产品。Annexin V-FITC PI染色试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞的常规培养 人大肠癌细胞系HCT116细胞复苏后,加入含10%FBS的RPMI-1640营养液,37℃恒温密闭式5%CO2培养箱培养,每2-3天传代一次,选择50代以内的细胞进行转染。

2.2 细胞转染 细胞传6孔板后,将配制的siRNA-Lip混和液加入含有细胞和转染液的孔中,使每孔转染总体积为1 ml,37℃培养6h;换新鲜不含抗生素的培养液继续培养至24 h,弃去培养液,换用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养48h。

2.3 细胞分组 正常对照组 (Opti-MEM培养基),脂质体对照组 (含Lip-2000的Opti-MEM培养基),阴性错配对照组 (含Lip-2000的Opti-MEM培养基加错配的 siRNA),脂质体+Survivin-siRNA组。

2.4 免疫细胞化学染色 (S-P法) 按试剂盒说明书操作,用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。

2.5 Western blot 用4℃预冷的PBS洗净培养液,吸干后每皿细胞加50μl含PMSF的裂解液,冰上裂解1h,4℃下12000rpm离心30min;取上清BCA法进行蛋白质定量。取含50μg蛋白质的溶液体积为上样量,加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS,煮沸10min使蛋白质变性;10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (130V)2小时;在80v电流下转膜2小时至硝酸纤维素膜上;用5%脱脂奶粉/TBST室温封闭30min;分别加入Survivin、Actin一抗 (1:500),4℃孵育过夜后,TBST洗膜3次,每次10min;加入二抗 IgG(1:5000),室温孵育2h;ECL显色,X胶片显影;

2.6 MTT实验 每组设4个复孔;转染24h、48h、72h后,每孔加入 20μl 0.5%MTT溶液继续培养4h;每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,用酶联免疫检测仪测量各孔的OD490nm波长处吸光度值;重复三次后,计算肿瘤细胞抑制率=(1-实验组OD值/正常对照组OD值) ×100%。

2.7 流式细胞术检测细胞增殖凋亡 转染48小时后,用不含EDTA的胰酶消化细胞15分钟,用1×Buffer A洗涤细胞一次 (离心 2000rpm,5min),收集并调整细胞浓度为1×106/ml;加入9倍体积的70%乙醇,于-20℃固定12小时;离心收集细胞后,除去乙醇,细胞重悬于500μl Buffer A中;加入 RnaseA使其终浓度为 0.25mg/ml,37℃,反应 30min;加入 5μl PI室温避光染色30min,按Annexin V-FITC PI染色试剂盒说明书操作,流式细胞仪检测。

2.8 统计方法 应用SPSS 13.0统计分析软件,计数资料采用Χ2检验或 Fisher精确概率计算法,阳性率之间的相关性采用Spearman秩相关分析比较,计量资料实验数据用均数±标准差 (¯x±s)表示,多组均数间的比较采用单因素方差分析,然后用SN K进行两两比较。两个率之间的比较采用泊松分布两样本率的Z检验。

结 果

1 免疫细胞化学结果 Survivn阳性信号主要定位于细胞浆呈黄-棕黄色,免疫细胞化学显示HCT116细胞系的正常对照组、脂质体对照组及阴性错配对照组细胞浆均呈深棕黄色表达 (强阳性);Survivin-siRNA转染组阳性程度明显减弱,呈淡黄色表达 (弱阳性)。重复3次,实验结果相似。见图1。

图1 A.HCT116细胞。HE×4001B.Survivin在阴性错配对照组 HCT116中阳性表达SP法 ×4001C.Survivin在 Survivin-siRNA组 HCT116中弱阳性表达。SP法 ×4001D.Survivin在正常对照组 HCT116中强阳性表达。SP法 ×400Fig.1A:HCT116 cells(HE staining×400)1B:Positive expression in negative mismatched control group.SP method×4001C:HCT116 cells showing weakly positive in survivinsiRNA interfered group.SP method×4001D:HCT116 cells showing positive expressing of survivin in the normal control group.SP method×400

2 Western blot结果 Western blot结果显示HCT116细胞系的Survivin-siRNA转染组,其蛋白条带亮度均明显低于正常对照组、脂质体对照组和阴性错配对照组。以上实验均用β-actin作内参照,重复三次,实验结果相似。见图2。

图2 Survivin-siRNA转染抑制 HCT116的Survivin蛋白表达1:正常对照组 2:脂质体对照组 3:阴性错配对照组 4:Survivin-siRNA转染组Fig.2 siRNA successfully inhibits survivin protein expression in colon cancer HCT116 cell line.1:Normal control group. 2:Lipofectamine 2000 control group.3:Mismatched control group.4:Survivin-siRNA interfered group.

3 MTT结果 以正常对照组细胞增殖抑制率为0,计算各实验组细胞增殖抑制率。SurvivinsiRNA转染组与其空白对照组及阴性错配对照组相比,细胞增殖的OD490值降低,其增殖抑制率明显高于空白对照组及阴性错配对照组 (P<0.05),随着时间增加 (24h,48h,72h),增殖抑制率逐渐升高,差异有统计学意义 (F=248.09,P<0.05)。(见表 1)。

表1 Survivin-siRNA转染后不同作用时间HCT116细胞系的增殖抑制率 (%)T able 1 The proliferation inhibition rates of HCT116 cell lines after Survivin-siRNA transfection(%)

＊P<0.05,HCT116细胞分别在转染Survivin-siRNA后24h、48h、72h,与对照组比较。

＊P<0.05,Compared with blank control and negative mismatched group at different times(24h,48h,72h),respectively.△P<0.05,Compared between different time point(24h,48h,72h)after survivin-siRNA transfection.

△P<0.05,Survivin-siRNA转染24h、48h、72h后,不同时间阶段间比较。

4流式细胞术结果 流式细胞术检测用针对Survivin特异靶点的siRNA转染 HCT116细胞48h后,结果显示空白对照和阴性错配对照细胞组凋亡细胞数目少,能指示凋亡的亚二倍体峰不明显 (M1值),两者相比无明显差异。Survivin-siRNA组出现明显亚二倍体峰,细胞凋亡比例为22.16%。见表2,图3。

表2 Survivin-siRNA转染后HCT116细胞系的凋亡比例T able 2 The apoptosis rates of HCT116 cell lines after Survivin-siRNA transfection

图3 流式细胞仪检测 HCT116转染48小时细胞凋亡。N:正常对照组,M:阴性错配对照组,HCT116:Survivin-siRNA转染组Fig.3 Flow cytometric analysis of HCT116 cells at 48 h after transfection with different siRNAs.The percentage of the pre-G 0-G 1 population(peak)is reported in each histogram.The peak indicates apoptosis rate of cells.N:Normal control group.M:Mismatched group.HCT116:Survivin-siRNA group.

讨 论

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成员,Survivin是1997年由耶鲁大学的Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-I的cDNA在人类基因组文库中筛选克隆出来的[2]。Survivin基因位于人类染色体l7q25,全长14.7kb,由3个内含子和4个外显子构成,编码含142个氨基酸残基、分子量为16.5kDa的胞浆蛋白。其能和纺垂体微管上的微管蛋白结合,抑制细胞凋亡[3]。研究发现Survivin在人的胚胎组织和多种肿瘤组织表达,而在正常组织不表达或低表达[4]。RNA干扰是自然界生物体的一种遗传现象,可以诱导目的基因沉默,高效、特异地抑制目的基因表达。小干扰RNA具有许多传统方法无法比拟的优势,包括特异性、高效性和放大效应[5-7],是目前靶向封闭目的基因的最佳选择。

研究应用RNA干扰技术,将针对Survivin特异靶点的小干扰RNA转染人大肠癌细胞系HCT116,免疫细胞化学显示阳性细胞数无明显减少,但阳性程度减弱(弱阳性);Western blot实验结果显示siRNA转染组的Survivin蛋白量同空白对照组和阴性对照组相比明显降低。上述结果提示Survivin-siRNA转染能抑制凋亡抑制基因Survivin的蛋白表达。

Survivin-siRNA转染后,细胞的增殖受到明显抑制,细胞生长速度明显变慢,细胞出现凋亡或凋亡增加,其原因可能是Survivin-siRNA转染人大肠癌细胞系后,SurvivinSurvivin蛋白表达下调或缺失,抑制多种因素如p53、Caspase等诱导的细胞凋亡作用减弱[8-9],导致有丝分裂过程中染色质分离错误,从而启动细胞周期中的自动检查机制,促发异常细胞凋亡[10]。Ikeguchi等[11]应用RT-PCR方法检测肝细胞癌中Survivin基因mRNA的表达量,证实Survivin的高表达能促进细胞分裂,导致细胞增殖过度。因此,Survivin基因被抑制后,细胞的增殖率下降,细胞的生长受到抑制。

总之,Survivin表达在大肠癌的发生中起重要作用,利用RNA干扰技术,将针对Survivin的siRNA转染大肠癌细胞后能明显降低Survivin蛋白表达,细胞生长被抑制,凋亡增加,为进一步以Survivin为靶点的大肠癌的靶基因治疗提供了理论依据。

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