HPLC法测定徐长卿中丹皮酚的含量*

李 珂 齐永秀 李玉琴 刘彩红 贾宝秀

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

徐长卿(PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum)为萝摩科多年生草本植物，以干燥根及根茎或全草入药，性温，味辛，有行气止痛、祛风湿、止痹痛的功效，可治疗风湿性关节炎、荨麻疹、湿疹、牛皮癣、跌打损伤、寒气腹痛、中暑等疾病[1]。本品含有丹皮酚、黄酮、氨基酸、多糖类、挥发油及少量生物碱等化学成分。丹皮酚为其主要有效成分，具有镇痛、解热、抗过敏、抗炎、抑菌、增强免疫功能等药理活性[2-3]。为检测和评价徐长卿药材质量，本研究建立了测定丹皮酚含量的高效液相色谱法，具有简便、快速、准确等特点。

1 实验材料

1.1仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，Agilent G1314A VWD 检测器，安捷伦化学工作站 B.01.01C SR1；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AP-01P型真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，GR-202型电子分析天平(AND Company)。

1.2药品与试剂

徐长卿为山东产中药材，经鉴定为萝摩科植物徐长卿的干燥根和根茎；丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号110708-200505)；甲醇为色谱纯；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1对照品与供试品溶液制备

2.1.1丹皮酚对照品溶液制备 精密称取丹皮酚对照品10.0 mg，置100 ml容量瓶中，加适量甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度为100 μg·ml-1丹皮酚对照品储备液。精密量取丹皮酚对照品储备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分别置25 ml容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，得质量浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0μg·ml-1丹皮酚对照品溶液。

2.1.2徐长卿供试品溶液制备

2.1.2.1提取时间考察 通过预实验，分别考察了徐长卿超声提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min的丹皮酚含量。结果超声提取20 min后，提取液中丹皮酚含量不再明显增加，故供试品溶液制备的提取时间确定为20 min。

2.1.2.2供试品溶液制备 精密称取徐长卿粗粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)20 min，放至室温，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1.0 ml，置50 ml容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，即得。

2.2色谱条件选择

2.2.1测定波长的选择 取4.0 μg·ml-1丹皮酚对照品溶液，以甲醇为空白对照，在200～400 nm波长范围内扫描。结果在274 nm和313 nm处有最大吸收，其中274 nm处灵敏度高，空白无干扰，故选择274 nm为检测波长。

2.2.2流动相的选择 文献方法[4]以甲醇-水(70︰30)为流动相，结果丹皮酚色谱峰对称性欠佳。本实验对流动相中甲醇与水的比例进行了考察比较，分别考察了甲醇比例为45%、50%、55%、60%、65%和70%时丹皮酚色谱峰的分离度、峰形及保留时间。结果显示甲醇-水的比例为50︰50时，丹皮酚色谱峰分离完全、保留时间短、峰形对称。

2.2.3色谱条件 根据预实验结果确定：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(4.6150 mm，5 μm)，美国安捷伦科技有限公司产品；流动相为甲醇-水(50︰50)，流速为1 ml·min-1；检测波长为274 nm；柱温：25 ℃；进样量20 μl。

2.2.4系统适用性实验 取上述丹皮酚对照品溶液和徐长卿供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。结果对照品和供试品中的丹皮酚色谱峰分离完全，峰型对称，无拖尾现象，保留时间为8.99 min。由对照品和供试品的丹皮酚色谱峰计算，理论板数分别为11103和9463。

图1 丹皮酚对照品(A)、徐长卿供试品(B)与溶媒(C)的HPLC色谱图

2.3标准曲线制备及线性关系考察

取上述质量浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 μg·ml-1丹皮酚对照品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以丹皮酚浓度(C)为横坐标，丹皮酚色谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。结果丹皮酚浓度在1.0～16.0 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系，经直线回归得回归方程为A=65.1808C + 5.1816(γ=0.9997，n=6)。

2.4精密度实验

取浓度4.0 μg·ml-1丹皮酚对照品溶液20 μl，在上述色谱条件下进样，重复进样6次，测定其峰面积。结果色谱峰面积平均值为545.90，RSD=2.06%(n=6)。

2.5供试品稳定性实验

取常温下放置的徐长卿供试品溶液20 μl，按上述色谱条件分别在0、1、2、3、4、5 h进样，测定丹皮酚峰面积。结果峰面积平均值为1138.54，RSD=0.89%(n=6)，表明供试品溶液在常温下放置5 h内稳定性良好。

2.6重复性实验

精密称取同一批号徐长卿供试品6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。结果丹皮酚含量平均值为1.89%，RSD=2.33%(n=6)。

2.7加样回收率实验

精密称取已知丹皮酚含量的徐长卿样品9份，分为3组，每组3份。3组样品分别准确加入高、中、低三种不同已知含量的丹皮酚对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法制成供试品溶液。取供试品溶液20μl进样，每一样品重复3次，测定丹皮酚含量，并计算回收率。结果平均回收率为98.15%，RSD<1.56%，见表1。

2.8样品含量测定

取徐长卿粉末3份,按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备溶液,分别取20 μl进样，重复进样3次，测定丹皮酚色谱峰面积。由标准曲线回归方程计算供试品中丹皮酚的含量。结果见表2。

表1 丹皮酚的加样回收率实验结果

表2 徐长卿中丹皮酚的含量测定结果

3 讨 论

丹皮酚为常用中药徐长卿的主要有效成分，其含量高低对药材质量和药品疗效具有重要影响[4]。丹皮酚具有熔点低(49.5～50 ℃)、易挥发的理化特性，可使药材在储存过程中致有效成分丢失。建立简便准确的丹皮酚含量测定方法，对评价徐长卿药材及其制剂的质量，保障药物临床疗效具有重要意义。本实验建立了测定徐长卿中丹皮酚含量的高效液相色谱法，具有简便快速、灵敏专一、结果准确等特点，适用于徐长卿药材质量控制，也可用于徐长卿制剂及其复方制剂中丹皮酚含量测定或药品质量控制。

[1] 武毅,刘刚,温海滨.徐长卿临床应用进展[J].江西中医学院学报，2006,18(5)：79-80.

[2] 巩丽萍，王少云. 徐长卿及丹皮酚的研究进展[J]. 食品与药品，2005，7(6A)：14-17.

[3] 郭婕，孙秀梅，张兆旺. 徐长卿的现代化学药理研究与临床应用近况[J]. 黑龙江中医药，2004，(1)：44-46.

[4] 付秀娟，朱大胜，潘书洋. 高效液相色谱法测定复肾宁胶囊中丹皮酚的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27(10)：1461-1462.