正交试验法优选薯蓣皂苷元萃取条件研究

王凤芝,荆洪英,孙姝岩

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯 154002;2.佳木斯市中医院,黑龙江佳木斯 154002)

穿龙薯蓣 (Dioscorea nipponica Makino)为薯蓣科薯蓣属植物,其根状茎药用名穿山龙。具有活血舒筋,消食利水,祛痰截疟之功效,用于治疗风寒湿痹、慢性气管炎,消化不良,劳损扭伤等[1]。民间多泡酒或水煎服,治疗筋骨麻木和腰腿酸痛。近年来研究证明穿龙薯蓣有调节免疫、改善心血管功能、镇咳、祛痰、平喘等多种药理作用,治疗类风湿性关节炎、冠心病、心绞痛、慢性气管炎、慢性布鲁菌病、脂肪瘤等疗效较好。穿龙薯蓣主要有效成分是薯蓣皂苷,水解产物薯蓣皂苷元是合成甾体激素和避孕类药物的主要原料之一[2]。由于其药理作用越来越被人们所认识,近年来在新药制剂不断开发的同时,也造成了野生资源急剧减少,日趋枯竭,目前已被列为国家二级保护植物[3]。

1 实验材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

穿龙薯蓣根茎 2005年 4月购于黑龙江省佳木斯市金天药店,经本校生药学教研室刘娟教授鉴定。

1.2 仪器及试剂

AE240电子分析天平 (METTLER公司),HA221-50-06超临界萃取装置 (江苏南通华安超临界萃取有限公司),80-2型离心机 (上海浦东物理光学仪器厂),Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司),101A-113型烘箱 (上海实验仪器厂有限公司),FZ102型粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司),HH-Z型恒温水浴锅 (郑州长城科工贸有限公司),RE-52A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);薯蓣皂苷元对照品 (中国药品生物制品检定所),甲醇为色谱纯,水为娃哈哈纯净水,95%乙醇,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交实验

经单因素实验分析,认为影响超临界萃取结果的因素主要有萃取温度、萃取压力、分离压力、分离温度。因此,选择萃取压力度 (A)、萃取温度 (B)、分离I压力 (C)、分离 I温度 (D)4因素安排 3个水平的正交实验,以薯蓣皂苷元收率为衡量指标。因素水平表见表1,正交设计表及结果 2,方差分析见表3。

表1 超临界 CO2萃取薯蓣皂苷元因素水平表

表2 正交设计表及结果

由表2可确定最佳萃取条件为 A2B2C2D1,即萃取压力 30 MPa,萃取温度 50℃,分离压力 10 MPa,分离温度 40℃。

表3 薯蓣皂苷元萃取率方差分析表

由方差分析的结果可知:因素B,因素 D影响显著。各因素对实验结果影响大小顺序为:B>D>A>C。由于直观分析优选出的最佳工艺条件未出现在正交试验表的安排中,需进一步验证试验来最终确定最佳工艺条件。

2.2 样品精制

将穿山龙药材干燥,用粉碎机粉碎并过 2号筛。精密称取药材粗粉 40 g放入圆底烧瓶中,加入 1 mol/L硫酸 400 mL,水浴加热 (80～90℃)回流 8 h。用碳酸钠粉末中和水解物至中性,抽滤。将滤渣烘干。将干燥滤渣投入萃取罐,当系统达到设定条件时,开始循环萃取,同时加入一定量的夹带剂 95%乙醇,并调节 CO2的流量到 24 L/h,保持恒温恒压。萃取完全后,从分离罐出料口出料,离心、精制得薯蓣皂苷元产品。105℃干燥至恒重,保存备用。

2.3 样品测定

配制标准品溶液每 mL甲醇含薯蓣皂苷元0.5 mg,在流动相为甲醇 ∶水 (84∶16),流速 :1.0 mL/min,检测波长为 203 nm,进样量为 20μL的色谱条件下测定。再准确称取 10 mg的超临界 CO2萃取产品加色谱纯甲醇使溶解,移置 10 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度,超声混匀。冷却后微孔滤膜 (0.45 μm)过滤待测,外标法定量。色谱图见图1～3。

图1 甲醇的 HPLC色谱图

图2 薯蓣皂苷元标准品的 HPLC色谱图

图3 薯蓣皂苷元产品的 HPLC色谱图

2.4 萃取率的计算

2.5 验证试验

按薯蓣皂苷元萃取率优选出来的工艺条件A2B2C2D1,A2B2C3D1进行提取操作,得到 2组薯蓣皂苷元产品。按“2.3样品测定方法”项下的相关内容进行操作,计算出薯蓣皂苷元萃取率,重复操作 5次。结果见表4。

表4 验证试验结果表

以薯蓣皂苷元萃取率为考察指标,A2B2C3D1法优于 A2B2C2D1法,故最终确定 A2B2C3D1法为穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的最佳提取工艺。即萃取压力30 MPa,萃取温度 50℃,分离 I压力 13 MPa,分离 I温度 40℃。

3 结论与讨论

我们对穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元的提取工艺进行了研究,最佳萃取条件为:萃取压力 30 MPa,萃取温度 50℃,分离 I压力 13 MPa,分离 I温度 40℃。

超临界 CO2提取薯蓣皂苷元时,在萃取过程中CO2可循环使用来降低消耗。超临界 CO2萃取技术工艺简便,可应用于医药生产,可节约大量的有机溶剂,避免易燃易爆的危险,生产周期短,安全高效[5],节约成本,带来可观的经济效益,有效利用药用植物资源。

在一定压力下,温度对薯蓣皂苷元提取的影响有 2种趋势:一是随温度的升高,产品收率逐渐增加,二是超过一定温度后随温度增加,产品收率呈下降趋势。这是由于温度升高,CO2流体的粘度下降,加强了其扩散能力,使得被萃取物在超临界 CO2中溶解度增加,但温度再增加,杂质的溶解度也会增加,使精制过程复杂化,从而降低产品收率;同时,温度增加,CO2流体的密度降低,使得对溶质的溶解能力下降,降低产品收率,因此,萃取温度是影响收率的一个重要因素。

[1] 江苏新医学院 .中药大词典 (下册)[M].上海:上海人民出版社,1977:1726.

[2] 陈延镛.甾体皂苷元的生产现状[J].医药工业,1985,16(1):32.

[3] 傅立国,金鉴明,祖元刚,等.中国植物红皮书 (第一册)[M].北京:科学出版社,1992.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:188.

[5] 王凤芝,刘 娟.薯蓣皂苷元的提取工艺比较[J].黑龙江医药科学,2006,29(4):22.