Rv2653c在大肠埃希菌中的克隆与表达研究

李邦印 孙卫国 程小星 孙昌文 熊志红 王仲元 王金河 苏锐

(解放军第309医院结核病研究室 北京 100091)

结核病是由结核分枝杆菌(M ycobacterium tuberculosis)所致的以呼吸道为主的慢性传染病,是目前危害全球人类健康的主要传染病之一。全世界每年约有(800～1 000)万新发结核病例。结核病疫情有日益严重的趋势,难于防治,主要原因之一是由于对结核病早期诊断和预防的不足。获得携有足够信息的结核分枝杆菌抗原,深入研究结核菌基因的功能,从分子生物学角度重新认识结核分枝杆菌凸显其关键性,并持续发掘其免疫诊断工具,变得越来越重要。差减杂交等实验中发现 Rv2653c(类似于phiRv2)与phiRv1在部分弱毒和无毒分枝杆菌中是缺失的,且鲜有文献对此进行专门研究[1]。2008年,我们合成了 Rv2653c引物,以 H37Rv基因组DNA为模板,用PCR方法扩增获得了Rv2653c基因,尝试在p ET24b载体进行了高效表达研究。本实验为进一步研究结核菌的遗传学特征和筛选新抗原奠定了基础。

1 资料和方法

1.1 菌株和质粒来源 菌株:结核分枝杆菌 H37Rv株来源于生物制品检定所;E.coli DH5α、E.coli BL 21(DE3),本室保存。质粒:表达质粒载体p ET-24b(Novagen)。临床抗血清:5例结核病患者血清,结明实验3项检测结果均为强阳性结果,明确诊断为肺结核。

1.2 主要试剂 EcoRⅠ,HindⅢ,T4 DNA Lig

ase(New England Biolabs);琼脂糖、p GEM-T vector System-Ⅰ、IPTG、X-Gal、4 ×dN TP(Promega);Plantinum Taq DNA polymerase(Invitrogen);DNA快速纯化试剂(赛百盛公司);蛋白质分子量标准(Sigma);Chelating Sepharose Fast Flow蛋白纯化试剂(Amersham Pharmacia);Western blo ting lum ino reagent(Santa cruz);辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG(北京中山生物制品公司);引物合成和测序服务(上海生物工程公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计 根据结核分枝杆菌基因组序列,针对RV 2653c基因设计一对引物,采用 PCR扩增的方法,以 H37Rv标准株基因组DNA为模板,扩增目的基因。直接将基因插入克隆载体p GEM-T。正义链引物 :5′accggaattcttgacccacaagcgcactaaac;反义链引物 :5′gcccaagcttctgtttgctgtcgggttcgtc;两端分别采用EcoR I和 Hind III限制性酶切位点。

1.3.2 PCR扩增Rv2653c基因 PCR反应程序:95℃×5min;94℃×20 s,60℃×20 s,72℃×90 s,32循环;72℃延伸7min。

1.3.3 琼脂糖电泳回收DNA片段 1.5%琼脂糖电泳结束后,用干净的手术刀片切下约0.5 kb DNA条带,放入无菌的eppendrof管中,操作方法参照DNA回收试剂盒说明。

1.3.4 基因克隆与测序 PCR产物与p GEM-T连接,参照p GEM-T vecto r System-Ⅰ产品说明,克隆载体的鉴定初步采用蓝白斑筛选,然后以PCR和限制性内切酶酶切的方法鉴定白斑菌落。重组子样品质粒送往测序公司。

1.3.5 构建表达载体p ET24b-Rv2与鉴定 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性内切酶从p GEM-Rv2切下约0.5 kb大小的基因片段与经过同样双酶切的p ET24b的进行快速连接,然后转化DH5α,克隆筛选与鉴定具体方法均参照《分子克隆实验指南》。将p ET24b-Rv2重组质粒重新测序。

1.3.6 重组蛋白的表达及其产物鉴定 (1)诱导表达:分别将p ET24b-Rv2阳性克隆质粒转染BL21(DE3),挑单克隆转种于5m l含50μg/m l卡那霉素的LB培养液中,37℃恒温振荡器培养过夜,然后以0.5%的比例转接到200 m l含50μg/m l卡那霉素的LB培养液,37℃培养至OD600值约0.8～1.0时,加入 IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,诱导 4～5 h。取出 ,冰浴 30min,离心 4 000 rpm ×10min,收集菌体,用 SDS-PAGE电泳方法鉴定表达产物。(2)纯化重组蛋白末端携6个组氨酸,可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合。试剂及纯化方法参照纯化试剂盒的操作按说明书进行。收集纯化蛋白,用PEG浓缩后再透析,采用Low ry法定量蛋白浓度。1.3.7 重组蛋白抗原性分析 取纯化蛋白进行SDS-PAGE,转PVDF膜,然后以5例临床结核患者血清多抗进行Western blot,采用辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG作为二抗,初步分析rRv2653c的特异性。Western blot实验操作参照《分子克隆实验指南》和化学发光试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 钓取 Rv2653c基因 以 H37Rv基因组DNA为模板,进行 PCR扩增获得了大小约为0.5 kb的DNA片段。

2.2 Rv2653c的克隆与鉴定

2.2.1 克隆与 PCR扩增鉴定 由结核菌基因组DNA扩增来的PCR片段经纯化后直接与p GEM-T连接、转化,挑选单克隆菌落快速提取质粒,以此为模板,采用Rv2653c上、下游引物进行PCR扩增;鉴定结果见图1。阳性重组子命名为p GEM-Rv2。

2.2.2 酶切鉴定 取重组质粒5μl,用 EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切2 h;1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,重组质粒可以切下约0.5 kb的片段见图1。

2.2.3 序列测定 阳性重组子经测定序列如下:与报道的序列一致。

图1 p GEM-Rv2重组子鉴定

图2 图2 p ET24B-Rv2重组子鉴定

2.3 构建重组表达载体及其重组蛋白的表达和纯化

2.3.1 重组表达质粒的鉴定 采用 EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切方法鉴定重组子(图2)。发现均可以得到大小约为0.5 kb的DNA片段,重组子命名为p ET24b-Rv2,重新测定序列,见图3。序列符合预期。

2.3.2 重组蛋白的诱导表达与纯化 p ET24b-Rv2重组质粒转化BL 21(DE3),用 IPTG诱导表达,收集菌体,用 SDS-PA GE电泳鉴定表达产物,发现重组蛋白产量约占菌体总蛋白的20%左右。采用Chelating Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,最后得到的重组蛋白产品纯度可以达到90%以上(图4)。

图3 p ET24b-Rv2重组子基因序列

图4 p ET24b-Rv2重组蛋白的表达与纯化电泳鉴定图谱

2.3.3 重组蛋白抗原性分析 对纯化的融合蛋白进行Western blot分析,结果见图5。结果显示:重组蛋白与与结核患者血清有较强的反应性,有抗原性。

图5 重组蛋白的western blot分析

3 讨论

结核分枝杆菌基因组的遗传学演化史就是微生物适应微环境,与时俱进的历史,结核菌不断演化、进化,以适应外环境和人们对结核病的处置方式。部分结核菌菌株测序工作完成后,人们发现结核菌基因组中有很多外来基因,这些基因可能在结核菌的不同生活时期扮演着不同的角色。

Rv2653c是我们在强毒菌株与弱毒株间进行差减杂交分析得到的1个基因,基因组大小约10 kb,编码107个氨基酸,其富含脯氨酸,与前噬菌体蛋白phiRv1和phiRv2序列有类似性,其蛋白结构与其他细菌中噬菌体包装相关蛋白类似[2-5],它们在致病性结核菌如M TB、牛型分枝杆菌等中存在,而在非致病的卡介苗等弱毒株的基因组中丢失,有一定的遗传学研究价值,相关文献很少。它们在致病菌中出现而在非(弱)致病菌中缺失的表现非同寻常,值得我们进一步去探索它在结核菌中的功能。目前该蛋白市场上有商品化的国外重组产品,而国内没有相关的研究。

本研究在大肠埃希菌中高效表达Rv2653c基因,获得了高效表达的工程菌株,得到纯度达到90%以上的重组蛋白。Western blot分析发现,重组蛋白与结核病患者血清反应强烈,这充分说明该重组蛋白的抗原性很好。抛开其遗传学的角色概念,该蛋白可能还是一种潜在的诊断用抗原,该蛋白的免疫原性为其血清学检测指示了另外的研究方向。

未来,我们将一方面利用现有的重组蛋白做一些有关其遗传学角色的工作,阐述其在结核菌中的功能;另一方面,我们将进行血清学特异性分析,并尝试作为若干抗原成分之一,开展Elispot等方面的实验,探讨其是否可作为一种候选的诊断用抗原。

[1]熊志红,庄玉辉,李国利.差显技术分析结核杆菌 H37Rv与H37Ra差异表达的基因[J].微生物学通报,2005,3(2):57-61.

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