GADD45β和 survivin基因在人原发性肝癌组织中的蛋白表达及意义

朱志杰,黄修明,邝继孙,谷 渊,董 星,赵龙栓

(郑州大学第一附属医院肝胆胰脾外科,河南省高等学校肝胆胰外科与消化器官移植重点学科开放实验室,河南郑州 450052）

GADD45β和 survivin基因在人原发性肝癌组织中的蛋白表达及意义

朱志杰,黄修明,邝继孙,谷 渊,董 星,赵龙栓

(郑州大学第一附属医院肝胆胰脾外科,河南省高等学校肝胆胰外科与消化器官移植重点学科开放实验室,河南郑州 450052）

目的探讨GADD45β和survivin基因在人原发性肝癌(HCC）组织中的蛋白表达及意义。方法收集不同分化程度的HCC组织标本 68例,正常肝组织标本 20例,采用免疫组化S-P法检测 GADD 45β和 survivin基因的蛋白表达。结果GADD 45β基因与survivin基因在 HCC组织中的蛋白表达率分别为 38.24%(26/68）和 75.00%(51/68）,两者的表达均与 HCC的病理分化程度、临床分期有关(P＜0.05）,survivin基因的表达还与门脉癌栓有关(P＜0.05）。随着 survivin基因在 HCC组织中蛋白表达率的升高,GADD45β基因蛋白表达强度明显下降,两者的表达呈负相关(r=-0.454,P＜0.05）。结论GADD 45β基因在HCC发生发展中起抑制作用,GADD 45β基因表达缺失是HCC发生发展的重要因素之一;survivin基因的异常表达在肝癌的发生发展中起促进作用。联合检测 GADD 45β基因和survivin基因的蛋白表达有助于判断 HCC的恶性程度和HCC患者的预后。

生长阻滞和 DNA损伤诱导基因;survivin基因;原发性肝癌;免疫组化

人原发性肝癌(human hepatocellular carcinoma,HCC）的发生是一个多基因参与并通过不同基因在不同时相的差异性表达进行调控的复杂过程[1]。细胞DNA损伤诱导生长阻滞和 DNA损伤诱导基因(growth arrest DNA damage-inducible gene 45β,GADD 45β）表达使细胞发生 G2/M期阻滞,调节细胞凋亡和存活等多条信号通路,GADD45β在决定细胞存活中发挥着重要作用[2]。survivin是1997年由 Ambrosini发现的一种细胞凋亡抑制因子,在胚胎发育过程中出现,在终末分化的成人组织中无表达(胸腺除外）,而在转化细胞株和人体内几乎所有的恶性肿瘤组织中均有明显表达[3]。本研究应用免疫组化法检测正常肝组织和不同病理分化程度的HCC组织中GADD45β基因与survivin基因的蛋白表达水平,并探讨两者的关系及临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我院 2009年 1月至 2009年 8月手术切除并经病理证实的 HCC 68例,术前均未接受化疗及放疗,其中男性 37例,女性 31例,年龄 31～79岁,平均年龄(46±7.2）岁。另取 20例正常肝组织作为对照,其中男性 12例,女性 8例,年龄 29～75岁,平均年龄 (49±4.7）岁。68例 HCC中,AFP≥400μg/L 43例 ,AFP＜400μg/L 25例 ;瘤径≥5 cm 24例,瘤径 ＜5 cm 44例;包膜完整 37例,包膜不完整或无包膜 31例;有脉管癌栓 21例,无脉管癌栓 47例;临床分期Ⅰ ～Ⅱ期 33例,Ⅲ期 35例;病理分化程度低分化 29例,中高分化 39例。

1.2 试剂 GADD45β基因表达诊断试剂盒、survivin基因表达诊断试剂盒、S-P免疫组化试剂盒、DAB试剂盒及

阳性参考切片均购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.3 方法 GADD45β基因与 survivin基因表达检测均采用免疫组化 S-P法,标本为 4μm石蜡标本切片,严格按照试剂盒说明操作。阳性对照为已知阳性切片,滴加 PBS液代替一抗的切片作为阴性对照。

1.4 结果判定 显微镜下观察免疫组化染色后的病理切片,两者的阳性反应均为细胞质内黄色、棕黄色颗粒,对每张病理切片随机计数 5个视野(×200）中GADD 45β基因和 survivin基因的阳性表达细胞比率。(-）为全部阴性表达或阳性表达细胞比率 ＜5%;(+）为阳性表达细胞比率 6%～20%;(++）为阳性表达细胞比率 21%～50%;(+++）为阳性表达细胞比率 ＞50%[4]。

1.5 统计学处理 应用 SPSS16.0软件进行统计学分析,率的比较采用 χ2检验或 Fisher精确概率法,相关分析采用Spearman等级相关分析法,检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 GADD45β基因与 survivin基因在 HCC及正常肝脏组织中的蛋白表达 GADD45β基因表达在细胞浆,阳性表现为弥漫性棕黄染色。HCC组织中 GADD45β基因的蛋白阳性表达率为 38.24%(26/68）,明显低于正常肝组织的 85.00%(17/20）(P＜0.05）。survivin基因表达在细胞浆,偶可见于细胞核,阳性表现为颗粒样棕黄染色。HCC组织中 survivin基因的蛋白阳性表达率 75.00%(51/68）,明显高于正常肝组织的25.00%(5/20）(P＜0.05）。见表 1。

表 1 Gadd45β基因和 survivin在 HCC组织及正常肝组织中的蛋白表达(例）

2.2 GADD45β基因与 survivin基因的蛋白表达与HCC临床病理参数的关系 GADD45β基因与 survivin基因在HCC组织中的蛋白表达均与肿瘤病理分化程度及临床分期有关(P＜0.05）;survivin基因的蛋白表达还与门脉癌栓有关(P＜0.05）;两者的表达与 HCC肿瘤大小、有无包膜、血清 AFP浓度均无关(P＞0.05）。见表 2。

表 2 Gadd45β基因和 survivin基因的蛋白表达与临床病理参数的关系

2.3 HCC组织中 GADD45β基因与 survivin基因的蛋白表达的关系 HCC组织中 GADD45β基因与 survivin基因蛋白表达均为阳性者占 17.65%(12/68）。GADD45β基因蛋白表达阳性者的 survivin基因蛋白表达阳性率为 46.15%(12/26）,GADD 45β基因蛋白表达阴性者的 survivin基因蛋白表达阳性率为92.86%(39/42）。survivin基因在 GADD 45β基因蛋白表达阴性者中的蛋白表达阳性率明显高于GADD45β阳性表达者(P＜0.05）。 GADD45β基因与survivin基因在 HCC组织中的蛋白表达呈负相关(r=-0.454,P＜0.05）。见表 3。

表 3 GADD 45β基因和survivin基因在 HCC组织中蛋白表达的相关性(例）

3 讨论

人类 survivin基因定位于染色体 17q25,全长14.7 kb,由 3个内含子和 4个外显子组成,其 mRNA长约 1.9 kb,所编码的蛋白包含了 142个氨基酸,作为IAP家族中相对分子质量最小(仅16 500）的成员,survivin蛋白在结构上具有众多不同之处,包括氨基端的BIR序列、羧基末端的 α螺旋结构及 BIR序列和 α螺旋结构间的特殊性连接区域(该区域具有输出信号功能而引起 survivin抗凋亡）[5]。基于其独特的分子结构,survivin可以在抑制细胞凋亡,促进细胞增殖分化,促进新生血管形成及与其他肿瘤相关因子相互作用等多方面、多途径促进肿瘤的发生发展[6]。本结果显示,survivin基因在 HCC组织中的蛋白表达阳性率为75.00%,明显高于正常肝组织的 25.00(P＜0.05）;且病理分化程度低、临床分期差、门脉内癌栓者survivin基因蛋白表达阳性率高(P＜0.05）。这提示 survivin基因与 HCC的发生发展有关。

GADD45基因家族是 DNA损伤修复的重要相关基因,在细胞凋亡和细胞生存中发挥作用。GADD45β的 mRNA全长是 1 121 bp,位于 19p13.3,属于核蛋白。GADD45β基因具有 GADD45基因家族的共有功能,即主要调节控制细胞的增生、监测细胞周期、诱导细胞凋亡、调节控制细胞的负性生长等 DNA损伤修复途径相关的功能[7]。GADD45β主要通过调控抑癌基因 p53来抑制细胞生长及促进细胞凋亡,GADD45β表达或功能异常导致 p53介导的 DNA损伤修复途径异常或阻断,不能正确应答 DNA损伤、抑制异常细胞的增生、控制细胞周期、促使凋亡的发生,致使损伤积累,是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制[8]。本研究结果显示,HCC组织中 GADD45β的蛋白表达阳性率为 38.24%,明显低于正常肝组织的 85.00%(P＜0.05）,说明 GADD45β基因缺失或蛋白表达异常对 HCC发生发展有重要意义;且临床Ⅲ期 HCC患者GADD45β基因蛋白表达阳性率明显高于Ⅰ ～Ⅱ期(P＜0.05）,表明 GADD45β能很好的反应 HCC进展情况及患者预后。

本组资料还显示,GADD45β基因与 survivin基因在 HCC组织中的蛋白表达呈负相关,推测可能是在GADD45β基因缺失或不能正常表达的情况下,组织细胞不能正常修复各种内外因素(电离辐射、紫外线、化学物质、病毒感染等）造成的基因损伤或突变致使细胞增殖、分化等生长调控机制紊乱,细胞出现异型性和恶性增殖,而 survivin基因的异常增加又使细胞的凋亡机制受阻导致机体清除变异细胞的能力下降。GADD45β缺失或不能正常表达与 survivin高表达同时存在的 HCC患者癌细胞增殖侵袭能力强、肿瘤分化差、恶性程度高、术后复发转移概率大,因此联合检测GADD45β基因与 survivin基因的蛋白表达有助于筛选高危患者及判断预后。大多数抗肿瘤药物都是通过损伤肿瘤细胞 DNA而发挥作用的,但现阶段还没有化疗药物对 HCC敏感,survivin在 HCC组织中异常高表达为 HCC化疗提供了新的靶点,GADD45β在 HCC细胞中特异性缺失或低表达提示我们可通过基因转染或其他可能的方法诱导上调肝细胞 GADD45β的表达而达到治疗 HCC及预防 HCC发生的目的。

[1] Ozturk M.Genetic aspects of hepatocellular carcinogenesis[J].Sem in Liver Dis,1999,19(3）:235-242.

[2] 李云峰,钱海利,林晨,等.Gadd45a的表达调控与功能[J].医学分子生物学杂志,2007,4(5）:434-438.

[3] Ambrosini G,Adida C,A ltieri DC.A novelanti-apoptosisgene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].NatMed,1997,3(8）:917-921.

[4] Ito T,Shiraki K,Sugimoto K,et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2000,31(5）:1080-1085.

[5] Lens SM,Rodriguez JA,Vader G,et al.Uncoupling the central spindle-associated function of the chromosomal passenger complex from its role at centromeres[J].Mol Biol Cell,2006,17(4）:1897-1909.

[6] Nikolovska-Coleska Z,Meagher JL,Jiang S,et al.Interaction of a cyclic,bivalent smacm imetic with the x-linked inhibitor of apoptosis protein[J].Biochem istry,2008,47(37）:9811-9824.

[7] Qiu W,Zhou B,Zou H,etal.Hypermethylation of growth arrest DNA damage-inducible gene 45 beta promoter in human hepatocellular carcinoma[J].Am JPathol,2004,165(5）:1689-1699.

[8] 邱伟华,Binsen Zhou,Dana Darwish,等.GADD45β基因表达诱导对不同 p53状态的肝癌细胞作用[J].外科理论与实践,2005,10(2）:155-160.

The Expressions and Clinical Significances of Survivin and GADD45βGene in Human Hepatocellular Carcinoma

Zhu Zhijie,Huang Xium ing,Kuang Jisun,Gu Yuan,Dong Xing,Zhao Longshuan
(Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University;

Key Laboratory of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery＆Digestive Organ Transplantation at Henan Universities,Zhengzhou 450052,China）Abstract:Objective To study the expressions and clinical significances of GADD 45βand survivin gene in human hepatocellular carcinoma(HCC）.MethodsImmunohistochem icalmethod was used to detect the expressions ofGADD 45βand survivin in both HCC and normal liver tissues(68 cases of HCC and 20 cases ofnormal liver tissues）.ResultsThe positive rates of GADD45βand survivin expressions in HCC tissues were 38.24%(26/68）and 75.00%(51/68）respectively.The expressions ofGADD 45βand survivin were both closely correlated with the differentiation degree and clinical stage of HCC(P＜0.05）.The expressions of survivin in HCC tissueswere also related to tumor thrombus of portal vein.And the expressions of GADD45βhad negative correlation with the expressions of survivin in HCC tissues(r=-0.454,P＜0.05）.ConclusionGADD45β may inhibit the occurrence and development of HCC,but survivin may have the opposite effect.Combined detection of GADD45βand survivin expressionsmay be beneficial to determine themalignancy degreeand predict prognosis of HCC.

growth arrest DNA damage-inducible gene 45β;survivin;human hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry

R 735.7;R 730.23

A

1673-5412(2010）05-0379-03

朱志杰(1985-）,男,在读硕士,主要从事肝胆胰脾疾病的基础与临床研究。E-mail:zhuda1258@126.com

赵龙栓(1964-）,男,教授,主任医师,主要从事肝胆胰脾疾病的诊治研究。E-mail:zhaoruix@126.com

2010-07-07）