纳米ZnO对斑马鱼胚胎抗氧化酶系统的影响

田文静,白 伟,赵春禄,张智勇,崔俊安,何 潇,马宇辉,赵宇亮 (.青岛科技大学环境与安全工

纳米技术的迅猛发展使人造纳米材料在消费品和工业产品中得到广泛使用,但其特殊的物理化学性质可能会对人类健康和生态环境造成负面影响[1].已有文献表明纳米ZnO具有明显的生态毒性[2-4],但其毒作用机理目前仍不清楚.

氧化损伤被认为是纳米材料毒性的作用机制之一,但目前研究主要利用离体细胞或成年动物[5].然而,离体细胞培养条件与体内环境存在很大差异,体外细胞实验结果在外推到整体动物时存在一定的局限性;胚胎或幼体在发育阶段许多组织和器官尚未发育完全,没有形成完善的对外界刺激的响应机制(如免疫功能等),因此其对污染物的响应机制可能不同于成年动物.基于以上考虑,本研究以斑马鱼胚胎为模式生物,通过测定胚胎中主要抗氧化物含量和酶活性,研究纳米ZnO暴露对其抗氧化系统的影响,探讨ZnO抑制斑马鱼胚胎孵化的作用机理.

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年斑马鱼由北京大学生命科学学院遗传发育中心斑马鱼实验室提供,在本实验室循环养殖系统中驯养3个月后收集鱼卵.循环养殖水根据Brand等[6]的方法配制:每1000L去离子水中加入75g碳酸氢钠,18g海盐和8.4g硫酸钙,水温(28±1)℃,pH值为7.2,总硬度为62mg/L(以CaCO3计),电导率为485μS.光/暗周期为14h:10h.斑马鱼每日喂食2次人工孵化的卤虫幼体和1次虾片(购于广东揭阳市越群海洋生物研究开发公司).

1.2 试剂与仪器

试剂:纳米 ZnO(30nm,纯度＞99.9%)购自杭州万景新材料有限公司.纳米ZnO的物理、化学性质,包括粒径、溶解性等在先前的研究中已进行了详细表征[4].蛋白质测试试剂盒(BCA)购自碧云天生物技术研究所,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.其余化学试剂均为国产分析纯试剂.

仪器:KQ-50B型超声波清洗器(南京昕航科学仪器有限公司),MGC-250智能型光照培养箱(上海一恒科技有限公司),低温冰箱(Forma- 86C, USA),pH计(PB-10,Sartorius,Germany),高速冷冻离心机(Sigma3k15,Germany),酶标仪(SpectraMaxM2, USA),超声波细胞破碎仪(VCΧ105, USA).

1.3 纳米ZnO悬浮液的制备

试验用水均为充氧饱和的标准胚胎培养液(E3)[6]:5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.33mmol/ LCaCl2和 0.33mmol/LMgSO4,不含亚甲基蓝,并用NaHCO3溶液调节pH值至7.2.纳米ZnO储备液(100mg/L)的制备:直接将纳米 ZnO颗粒加入一定体积的E3培养液中(不使用助溶剂),在冰水浴中超声分散(50W,40kHz,30min).不同浓度纳米ZnO 悬浮液用 E3培养液逐级稀释制备:0,1, 5,10,50mg/L.考虑到纳米材料在水中极易团聚沉淀,纳米 ZnO悬浮液均为当天暴露前新鲜配制,使用前超声5min.

1.4 胚胎毒性实验

胚胎毒性实验根据 Best等[7]的方法稍加修改进行.即将 500 个正常受精卵(囊胚期,2.5～3h)加入到含800mL不同浓度纳米ZnO悬浮液的烧杯中,置于光照培养箱中,温度为(28±1)℃,光/暗周期为 14h:10h,处理 72h后收集胚胎和幼鱼.处理过程中及时挑出凝结卵,防止其对正常卵产生影响.每个处理重复5次.同时进行对应浓度Zn2+处理对比实验,步骤同纳米ZnO.

1.5 样品预处理和抗氧化指标测定

处理结束后,用 28℃去离子水清洗受试斑马鱼胚胎,去除表面附着的纳米ZnO和Zn2+,将胚胎和幼鱼置于离心管中,去除残余水分,称量后加入预冷匀浆介质(0.01mol/LTris-HCl,0.0001mol/ LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%NaCl, pH=7.4),在冰水浴中匀浆(8s/2s/60%/2min),离心匀浆液(4℃ ,13000r/min,10min),取上清液置于-80℃冰箱内保存待用.蛋白含量和抗氧化指标(GSH、SOD、CAT和MDA)测定均参考相应试剂盒说明书进行.

1.6 数据分析

实验数据表示为平均值±标准差(Mean±SD),采用 SPSS15软件进行单因素方差分析(onewayANOVA),处理组与对照组间差异显著性检验采用Dunnet’t法,对应浓度纳米ZnO和Zn2+处理组间差异显著性检验采用LSD法、Turkey法. P＜0.05表示差异显著.

2 结果

2.1 GSH变化

图1 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎GSH含量的影响Fig.1 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on GSH contents of zebrafish embryos

由图1可见,纳米ZnO处理24h后斑马鱼胚胎GSH含量低于对照组, 50mg/L纳米ZnO处理后斑马鱼胚胎GSH含量显著降低; Zn2+处理24h后,斑马鱼胚胎 GSH含量低于对照组,但无显著性差异.50mg/L纳米ZnO处理48h后,斑马鱼胚胎GSH含量显著降低;5.3mg/L Zn2+处理48h后,斑马鱼胚胎GSH含量显著降低.纳米ZnO处理72h后,斑马鱼胚胎无显著差异;Zn2+处理72h后,斑马鱼胚胎GSH含量低于对照组,5.3mg/L Zn2+处理组 GSH含量显著降低.在相同处理时间内,对应浓度纳米ZnO和Zn2+处理组间斑马鱼胚胎GSH含量无显著性差异.

2.2 SOD活性变化

由图2可见,处理24h后,除1mg/L外,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎SOD活性均显著低于对照组;Zn2+处理组斑马鱼胚胎SOD活性随Zn2+浓度增大而逐渐降低,3.6,5.3mg/L处理组SOD活性显著降低. 处理48h后,纳米ZnO和Zn2+处理组斑马鱼胚胎SOD活性表现出逐渐降低趋势,但均无显著性差异.处理72h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎 SOD活性随纳米 ZnO浓度增大而降低,10,50mg/L处理组斑马鱼胚胎SOD活性显著低于对照组; Zn2+处理组斑马鱼胚胎 SOD活性表现出逐渐降低趋势,但与对照组无显著性差异.对比实验结果表明,在相同处理时间内,对应浓度纳米ZnO和Zn2+处理组间斑马鱼胚胎SOD活性无显著性差异.

图2 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎SOD活性的影响Fig.2 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on SOD activities of zebrafish embryos

2.3 CAT活性变化

由图3可见,处理24h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎CAT活性逐渐降低,均显著低于对照组; Zn2+处理组斑马鱼胚胎 CAT活性逐渐降低,3.6, 5.3mg/L处理组斑马鱼胚胎 CAT活性显著低于对照组.处理48h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎CAT活性低于对照组,其中5,10,50mg/L处理组CAT活性显著低于对照组;Zn2+处理组CAT活性逐渐降低,3.6,5.3mg/L处理组CAT活性显著低于对照组.处理72h后,纳米ZnO和Zn2+处理组斑马鱼胚胎CAT活性均低于对照组,但无显著性差异.实验结果表明,1mg/L纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎CAT活性显著低于0.6mg/L Zn2+处理组.

图3 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎CAT活性的影响.Fig.3 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on CAT activities of zebrafish embryos

2.4 MDA含量变化

由图4可见,处理24h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎MDA含量逐渐升高,10,50mg/L处理组斑马鱼胚胎 MDA含量显著高于对照组;Zn2+处理组斑马鱼胚胎 MDA含量均高于对照组, 6.3mg/L处理组MDA含量显著升高.处理48 h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎MDA含量逐渐增大,均显著高于对照组,5.3mg/L Zn2+处理组斑马鱼胚胎 MDA含量显著高于对照组;对比实验发现,1,5,10mg/L纳米 ZnO处理组斑马鱼胚胎MDA含量均显著高于对应浓度 Zn2+处理组(0.6,2.2,3.6mg/L).处理72h后,纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎 MDA含量逐渐增大,均显著高于对照组,Zn2+处理组斑马鱼胚胎 MDA含量与对照组相比无显著性差异;对比实验结果表明,在处理48,72h后,10,50mg/L纳米ZnO处理组斑马鱼胚胎 MDA含量均显著高于对应浓度 Zn2+处理组(3.6和5.3mg/L).

图4 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎MDA含量的影响.Fig.4 Effects of Nano-ZnO/Zn2+ on MDA contents of zebrafish embryos

3 讨论

本课题组[5]发现,50,100mg/L纳米ZnO导致斑马鱼胚胎死亡,1～25mg/L纳米ZnO明显抑制斑马鱼胚胎孵化,并导致幼鱼体长变短和产生尾部畸形.对比实验表明 Zn2+的释放不能完全解释纳米ZnO所致斑马鱼胚胎毒性.本研究试图从氧化应激角度探讨纳米ZnO毒作用机理.氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多,超过机体防御系统的清除能力,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致机体组织损伤,如脂质过氧化、酶失活、DNA断裂等[8].

GSH是一种具有特殊生物学功能的氨基酸衍生物,属于含有巯基的小分子肽类物质.在外界刺激下,GSH会被诱导,清除体内产生的自由基,如果 GSH耗竭则导致机体产生中毒效应. Usenko等[9]发现在处理过程中加入谷胱甘肽前体(N-乙酰半胱氨酸 NAC)能够降低富勒烯(C60)单独处理引起的斑马鱼胚胎死亡率和心包囊肿现象,而加入谷胱甘肽合成抑制剂(丁硫氨酸硫酸亚胺BSO和马来酸二乙酯DEM)却能够增大斑马鱼胚胎对 C60处理的敏感性.Zhu等[10]发现直接加入GSH能够减轻C60处理引起的斑马鱼胚胎发育毒性,认为 C60通过氧化应激机制发挥其毒作用.本研究发现,纳米ZnO处理24h、48h和72h后,处理组胚胎GSH含量均发生不同程度降低现象,这一现象可能是由于纳米ZnO处理导致受试胚胎体内自由基增多,从而消耗体内GSH,进而导致其含量降低.

SOD是一种清除超氧阴离子(O2-·)的特异性酶,能够与 O2-·作用发生歧化反应,将其分解为H2O2和 O2,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用.Sharma等[11]研究了纳米 ZnO对人上皮细胞系(A431)的影响,发现纳米ZnO能够消耗GSH,降低CAT活性和SOD活性,引起氧化损伤,并进而引起A431细胞的基因毒性.朱小山等[12]发现长期低剂量富勒烯(C60)处理能够引起鲫鱼的氧化伤害,显著降低鲫鱼脑、肝脏、鳃组织中GSH含量,降低肝脏组织中CAT和SOD活性.本研究结果表明纳米ZnO处理导致斑马鱼胚胎 SOD活性随处理浓度增加呈现出降低趋势,这些现象表明纳米ZnO处理导致受试胚胎体内O2-增多,超出了SOD酶清除能力,反过来抑制了SOD活性.

CAT是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40%,是一种酶类清除剂,可促使体内H2O2分解为分子氧和水,使细胞免受H2O2的毒害,是生物防御体系的关键酶之一.Turkez等[13]发现纳米TiO2能够导致人全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)、CAT、SOD活性降低,诱发氧化应激并导致DNA损伤.Kalper等[14]发现氢化C60(hydrogenated C60, C60-Hx)、羟基化C60(hydroxylated C60,C60-OH)和纳米TiO2能够增大CAT活性,但搅拌制备和THF制备的nC60对CAT活性没有影响,认为氧化应激标志物(如CAT, GST等)可用来预测纳米材料的潜在毒性.Wang 等[15]发现[Gd@C82(OH)22]n能够降低小鼠肝CAT和SOD活性.本研究中纳米ZnO处理24h和48h能够降低斑马鱼CAT活性,表明纳米ZnO对CAT活性具有明显的抑制作用.

MDA是生物膜中多种不饱和脂肪酸在氧自由基攻击下形成的脂质过氧化产物，其含量变化可反映出机体损伤的程度.SOD和GSH-Px活性的降低,可导致机体脂质过氧化物产生,MDA含量增大. Wang等[16]发现硅纳米粒子(20和50 nm)能够诱导人胚胎肾细胞产生ROS,降低胞内GSH含量,引起人胚胎肾细胞MDA含量增大,产生细胞毒性.Sayes等[17]发现C60处理48 h可导致人真皮纤维原细胞(HDF)、人肝癌细胞(HepG2)、人神经胶质细胞(NHA)MDA含量增大,细胞膜完整性受损,GSH含量增大.本研究中纳米ZnO处理24h、48h和 72h,均导致受试斑马鱼胚胎 MDA含量增大,纳米ZnO处理48h和72h后导致MDA含量均大于相应浓度Zn2+处理组,表明纳米ZnO处理导致胚胎体内细胞膜损伤, 氧化损伤程度大于相应浓度Zn2+处理组.

4 结论

4.1 纳米ZnO对斑马鱼胚胎抗氧化指标均产生了不同程度的影响,表明纳米ZnO对斑马鱼胚胎产生氧化损伤,进而引起斑马鱼胚胎生理机能改变,导致不能成功孵化.

4.2 对比实验证明溶解释放的 Zn对纳米 ZnO毒性有一定的贡献,是其毒作用机制之一.

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