高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留

张宗祥,陈 军

(泰州市环境监测中心站,江苏 泰州 225300)

高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留

张宗祥,陈 军

(泰州市环境监测中心站,江苏 泰州 225300)

采用高效液相色谱法测定鱼组织中孔雀石绿的残留量。样品经高速均质后,用乙腈提取,合并提取液,用二氯甲烷再次萃取,有机相浓缩后过酸性氧化铝和 PRS复合小柱洗脱,用乙腈定容。以乙腈 -乙酸盐缓冲溶液为流动相,高效液相色谱分离,用荧光检测器检测,外标法定量。其检出限为 0.75μg/kg,加标回收率为 84.0%～90.1%,相对标准偏差 RSD为 2.98%～6.21%。

高效液相色谱;孔雀石绿;鱼体

0 引言

孔雀石绿是三苯基甲烷类工业染料,是药用染料中抗菌效力较强的一类,广泛应用于水产品养殖业,常用于防治鱼的增殖性肾病、水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等,也可在水产品贩运过程中用作消毒剂,以延长鱼类的存活时间。孔雀石绿被鱼体吸收后,可代谢为隐色孔雀石绿,并沉积在脂肪组织中,具有明显的残留现象,其残留时间达到 100d以上。动物试验证明孔雀石绿及其代谢产物对人畜有潜在的致畸、致癌和致突变作用,且代谢产物隐色孔雀石绿的危害更甚于其母体,故被我国及世界上很多国家禁止使用。

目前,检测孔雀石绿残留大多采用高效液相色谱法,紫外检测方法需要二氧化铅柱后衍生,过程繁琐。本实验参考 GB/T 20361—2006方法并作部分改良,将孔雀石绿还原成隐色孔雀石绿,采用荧光检测器,可以有效避免杂质干扰,具有高灵敏度,适合水产品中孔雀石绿残留的检测。

1 试 验

1.1 主要仪器和试剂材料

Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2475荧光检测器,超声波细胞破碎仪,高速离心机,旋转蒸发仪。

隐色孔雀石绿标准品 100mg/L,乙腈、二氯甲烷均为色谱纯,20%盐酸羟胺溶液、对甲苯磺酸、冰乙酸为分析纯,硼氢化钾 (纯度大于 95%)、二甘醇 (化学纯),酸性氧化铝固相萃取柱 1g/3mL,PRS固相萃取柱 500mg/3mL。

1.2 样品预处理

将鱼体去鳞洗净,割取背部肌肉 5.00g置于50mL离心管中,依次加入 10mL乙腈、1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对甲苯磺酸溶液和 5mL乙酸铵缓冲溶液,涡旋 2min,超声波破碎 10min。加入 5g酸性氧化铝,涡旋 2min,10 000r/min离心 15min。残渣中加入 10mL乙腈,涡旋 2min后,10 000r/min离心15min。合并 2次上层清液至分液漏斗中。

于上层清液中分别加入 2mL二甘醇、3mL硼氢化钾溶液和 30mL二氯甲烷,振摇 5min,静置分层10min。取有机相于 45℃旋转蒸发至近干,加入2.5mL乙腈溶解。

将上述液体过酸性氧化铝柱 (下接 PRS小柱),并以 5mL乙腈分 2次洗涤旋蒸烧瓶,一并过柱。弃去酸性氧化铝柱,将 PRS小柱吹至近干,加 3mL乙腈淋洗液,收集流出液并用乙腈定容至 3mL,过0.45μm,供液相色谱测定。

1.3 色谱分析条件

色谱柱 ：Atlantis dC18(4.6mm ×250mm,5μm)。

流动相：乙腈 -乙酸铵缓冲液 (pH=4.5),体积比为 80∶20。

进样量：10μL。

流速 ：1.0mL/min。

柱温：35℃。

激发波长：265nm。

发射波长：360nm。

2 结果与讨论

2.1 二氯甲烷和乙腈的比例

应适当增加二氯甲烷的萃取用量,否则萃取操作不容易进行。试验中,乙腈的用量为 20mL,当乙腈 ∶二氯甲烷 (V∶V)=1∶1时,由于乙腈对水的溶解度较大,分层不明显,萃取效率低下。试验中,二氯甲烷的加入量为 30mL,既缩短了分离时间,又提高了提取的效率。

2.2 洗脱液 pH

PRS为丙磺酸柱,在强碱性条件下才能将隐色孔雀石绿洗脱下来,乙腈洗脱液应用氨水调节在 pH值 =10左右。碱性过低,洗脱不下来;碱性过高,易损伤色谱柱。

2.3 色谱图和标准曲线

取孔雀石绿标准溶液系列,按色谱条件进行测定,以标准溶液的浓度对峰面积制作标准曲线,孔雀石绿的浓度在 5μg/L～100μg/L范围内呈线性,标准曲线为 ：A=28 733.71C-5 400;R2=0.999 8(图1、图 2)。

图1 孔雀石绿标准品色谱图

2.4 回收率和精密度

在空白样品中分别以 1μg/kg、5μg/kg和 10μg/kg的水平进行加标回收试验,结果见表 1。

表1 回收率及精密度试验(n=6)

2.5 检出限

在 5.0g空白样品中添加 5.0μg/mL标样1.00mL,得到加标浓度为 1.0μg/kg的样品,进行平行测定 6次,以 3倍的标准偏差计算检测限,本试验中孔雀石绿的检出限为 0.75μg/kg。

3 结 语

建立了鱼体中孔雀石绿检测的高效液相色谱 -荧光法。利用荧光检测器的选择性可以有效降低杂质峰的干扰,获得满意的检测结果。方法最低检出限 0.75μg/kg,加标回收率为 81.7%～90.1%,相对标准偏差为 2.98%～6.21%。本方法具有简便、快捷,精密度和准确度高的特点,适合对鱼体内孔雀石绿残留的检测。

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[4]SC/T 3021—2004,水产品中孔雀石绿残留量的测定[S].

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Determination of residues ofmalachite green in fish tissues by high-perfor mance liquid chromatography

(Taizhou Station of EnvironmentalMonitoring,Taizhou 225300 Jiangsu)

A high-performance liquid chromatography(HPLC)methodwas established for the determination ofmalachite green in fish tissues.The tissueswere blended thoroughly under acidic medium,chloride was used for re-extraction after the former extracts were combined.After evaporation,the organic phase was passed through the acid alumina column and PRS column,then resolved with acetonitrile.Taking acetonitrile-acetate buffer as the mobile phase,the residue levelswere determined by HPLC with fluorescence detector.External standard calibrationwas adopted in the deter mination.The detection limitwas0.75μg/kg,the valuesof recovery found by standard addition method were in the range of 84.0%～90.1%,and values of RSD were in the range of 2.98%～6.21%.

HPLC;Malachite green;Fish tissues

ZHANG Zong-x iang,CHEN Jun

S914

A

1674-3636(2010)02-0206-03

2010-01-12;编辑：侯鹏飞

张宗祥 (1976—),男,工程师,硕士,主要从事环境监测工作.

10.3969/j.issn.1674-3636.2010.02.206