扬州地区鸡病原性大肠杆菌的分离与鉴定

吴华俊　任　文　周梅霞　张春云

摘要对扬州市大型鸡场的大肠杆菌病情况进行了流行病学调查和临床诊断,对病死鸡进行了病理剖检,分离出病原菌142株,经生化试验、血清学鉴定,确诊为病原性大肠杆菌的128株。对扬州市大肠杆菌病常见血清型的种类、比例、分布有所了解,同时通过相关的致病性试验和药敏试验,为临床用药和免疫计划提供了可参考的理论依据。

关键词鸡;大肠杆菌;分离;鉴定;江苏扬州

中图分类号 S858.31 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0306-02

AetiologicalIsolationandIdentificationofE.colifromChickeninYangzhouArea

WU Hua-jun 1REN Wen 2ZHOU Mei-xia 2ZHANG Chun-yun 3 *

(1 Yangzhou Livestock Farm Veterinary Station,Yangzhou Jiangsu 225009; 2 Veterinary Station ofBali Town ,Development Zone of Yangzhou City; 3 Bureau ofAgriculture and Forestry ofYizheng City)

AbstractThe investigation on epidemiology and clinic diagnosis of E.coli were carried out in large chicken houses of Yangzhou in 2006. A total of 142 isolations were obtained from binganatomizing infected and dead chicken, and 128 isolations were identified through biochemical reactions and serotype test. The kinds of E.coli serotypes as well as the percent and distribution in Yanngzhou was investigated, and it might had potential effect onclinical drug-use and immunity plan through pathogenicity test and sensitive experiment.

Key wordschicken;E.coli;isolation;identification; Yangzhou in Jiangsu

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的多种疾病的总称,是家禽最常见的病原菌之一。主要存在于病鸡的肠道及分泌物与其他组织器官中,病鸡、鸡粪及污染种蛋为主要传染源。在生产中病鸡死鸡处理不当、种蛋消毒不严格、鸡舍及四周环境消毒不彻底、饲养管理差、饲喂污染的饲料和水等,均可促进该病的流行。该病全年均可发生,但以冬季和夏季多发,常呈地方性流行。鸡大肠杆菌病最常见的血清型是O1、O2、O78和O35,生产中使用的疫苗也以这几种为主。但从国内众多报道看,我国分离到的禽源性大肠杆菌的血清型众多,且不同地区差异较大,这将制约疫苗的免疫效果。

大肠杆菌病主要分为败血症、卵黄性腹膜炎、脐炎及全眼球炎等4个类型,其临床症状及剖检病变各不相同。为了掌握全市鸡大肠杆菌病病原性,笔者特进行了病原性大肠杆菌的分离与鉴定,为本病的免疫提供理论依据,同时进行药敏试验,为临床用药提供参考。

1材料与方法

1.1材料

病料来源于扬州市各鸡场与兽医站临诊上有典型大肠杆菌病病变的病、死鸡。葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、尿素、硫化氢、蛋白胨等生化发酵培养基和麦康凯培养基、营养琼脂为杭州微生物试剂有限公司生产;血清型鉴定所用营养琼脂斜面、营养肉汤、LB培养基参照有关文献配制。大肠杆菌标准抗O血清购自中国兽药监察所。试验鸡为1日龄雏鸡240羽,公、母各占1/2,购自中国农业科学院家禽研究所。药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌分离培养。无菌采取上述病、死鸡的心血、肝、气囊等病料划线于麦康凯斜面,37℃培养18h,挑取典型菌落在麦康凯平板上分区划线,37℃培养18h,选取单个典型菌落纯培养后冻干保存。

1.2.2生化试验。按文献报道方法对所有分离株进行10项生化指标的测定。

1.2.3血清型鉴定。所有分离株首先经玻板凝集试验初步筛选可能的O血清型,然后通过试管凝集试验确定其O血清型。定型标准为血清的试管凝集价不小于1∶640。参照文献进行。

1.2.4致病性试验。240羽1日龄雏鸡随机分为40组,每组6只,公、母各占1/2;按文献的方法,分别将10个O78、5个O2、5个O127、5个O18、5个O1、3个O4、3个O24、1个O88、1个O11和1个O26分离株用LB肉汤培养24h,取0.1mL(含约108cfu/mL)进行气管内注射,1组注射LB肉汤0.1mL作对照。每天上、下午各记录1次鸡的死亡数、病变,并以死亡鸡心血作细菌分离、鉴定,直到接种后7d为止,7d后仍存活的鸡进行扑杀,观察病变并作细菌分离鉴定。根据鸡的死亡数和病变程度确定分离株的致病性:一是高致病株。50%以上的接种鸡死亡或产生严重病变(心包炎、肝周炎、气囊炎、肝坏死等)。二是中度致病株。接种鸡不死亡,产生严重病变者不超过50%。三是低致病性分离株。接种鸡不死亡,仅在气囊上偶而产生病变。

1.2.5药敏试验。选取不同地区分离株10株,在无菌条件下将24h肉汤培养菌物,用灭菌生理盐水作10倍稀释,取0.2mL滴加在普通琼脂平板培养基上,用灭菌L棒涂匀,然后贴上纸片,每个平板贴5种纸片,置37℃温箱中培养18h,用游标卡尺测量抑菌环直径。

2结果与分析

2.1细菌分离

213只病死鸡,共分离出142株细菌,经生化鉴定,其中128个分离株属大肠杆菌。

2.2生化试验结果

128个分离株的10项生化试验结果符合大肠杆菌的特征。

2.3血清型鉴定结果

142个分离株中,除12株未能定型、2株自凝外,测定出128个分离株的血清型。血清型的分布及所占比例见表1。

2.4致病性试验结果

接种雏鸡主要表现精神沉郁,呼吸困难,翅膀下垂,缩颈,颈羽竖立,食欲下降或废绝,高致病性分离株引起接种雏鸡死亡高峰在12~24h;此间病死鸡病变主要为心包积液,气囊混浊和肝脏肿大、淤血。典型病变出现于接种后48h死亡鸡,可见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊上可见多量干酪样渗出物。病程越长,病变越典型。接种后7d内死亡鸡数:高致病株多在5～6只;中度致病株多在1～2只;低致病株则不见死亡,只见个别鸡气囊上有少量干酪样分泌物。对照鸡均健活,7日龄扑杀时未见任何病变,心、肝等处也未分离出任何细菌。从接种后死亡鸡或产生严重病变鸡体内均能分离到接种菌,所测39个分离株的致病性见表2。

2.5药敏试验结果

用游标卡尺测量抑菌环直径。抑菌环直径在15mm以上者为高敏;10～15mm为中敏;10mm以下为低敏;无抑菌环为耐药。从试验结果看,不同场、不同地区、不同菌株的对各种药物的敏感程度不尽相同,存在一定的差异性,但也存在某些共同点,即生产中很少用或从没用过的药敏感程度高,如林霉素钠、先锋类、阿米卡星等均为高敏感,生产中经常用的药敏感程度低或耐药,如青霉素类、氯霉素、磺胺类、诺氟沙星等均为低敏或耐药。

3结论与讨论

(1)在扬州市142个禽源性大肠杆菌分离株中,共测出128个分离株的血清型,其种类(血清型)达10个,但以O78、O2、O127、O18、O1为主,共109株,占定型菌株的85.16%;其中O78有40个分离株,占定型菌株的31.25%。因此,在本次调查中,O78、O2、O127、O18、O1等5个血清型为优势血清型。

(2)国外报道,禽致病性大肠杆菌常见血清型为O1、O2、O35和O78。本次调查所得5个优势血清型中,有2个不在此列,其中O127所占比例为13.28%,O18所占比例为10.94%,这2个血清型不仅不属国外常见的致病性血清型,国内也较少报道。因此,对非常见血清型分离株进行深入研究,将有助于了解我国禽大肠杆菌病的致病机理、免疫保护机理与防制措施。

(3)在128个定型菌株中,约60%的菌株在玻板上与2种或2种以上的标准血清反应,只有通过试管凝集试验才能确定其所属血清型;也有为数不少的菌株尽管在玻板上只与某一种标准血清反应,但作试管凝集时,凝集价又不够定型标准而判为未定型菌株。

(4)调查结果与国外、国内报道相比,扬州市禽大肠杆菌分离株存在多样性,但同时存在着优势血清型。

(5)生化试验结果表明,完全符合大肠杆菌生化特性的分离株占多数,极少数菌株在个别检测项上不符。因此,在作大肠杆菌的生化鉴定时,应多设一些有针对性的检验项,以便在个别检测项不符时,不致误判。

(6)所测39个分离株对1日龄雏鸡均有致病性。5个优势血清型分离株中,高度致病者占86.67%,中度致病者占10%,低致病者占3.33%,由此表明,所分离到的优势血清型分离株均有致病性。

(7)致病性试验结果表明,1日龄雏鸡需来自卫生防疫制度健全、鸡群状况良好的种鸡场,因为在试验期间不得使用任何抗生素类药物,健康对照鸡不得发病,且不能从其脏器分离到任何细菌。因此,有条件时,应采用SPF鸡。

(8)大肠杆菌分离株的致病性存在明显差异。绝大多数高致病株总能引起接种鸡高死亡率(致死比例常为5/6～6/6);中度致病株可引起较低死亡率(致死比例常为1/6～2/6);而低致病株则不引起死亡。因而,结合死亡鸡及扑杀鸡的病变程度,很容易判断其致病性的高低。

(9)致病性试验中,不同地区、不同血清型的受试分离株的致病性无明显差异。表明分离株的致病性不受地区、血清型的影响,与国外强调的致病性血清型多属O1、O2、O78,很少分离到其他血清型的结论并不完全一致。这只能说明,我国的禽大肠杆菌病比国外更复杂。多致病血清型的存在,给防制工作增加了难度;优势血清型的出现,又为最大限度地控制该病提供了条件。

(10)本试验进行的药敏试验结果表明,大肠杆菌病原菌的耐药菌株较多,耐谱较广,给临床治疗带来困难。在生产中最好能根据本场药敏试验结果选用药物进行治疗,如无条件做药敏试验,应尽可能选用以前不经常用或从未用过的药物进行治疗。

(11)为了控制本病的发生,应注意环境卫生及消毒,经常带鸡消毒,防止饲料及水源的污染,减少应激。支原体、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病的发生常能引发大肠杆菌病发生,所以应根据本地疫情特点制定切实可行的免疫程序,做好免疫接种工作,提高机体免疫力。

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