知母宁抗乙肝病毒作用的实验研究

丁蔚茅

摘要:目的:观察知母宁的抗乙肝病毒作用。方法:观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及对乙肝模型鸭DHBV-DNA的影响。结果:知母宁浓度为4 mg/mL时对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用;以200 mg/kg治疗乙肝模型鸭10d后DHBV-DNA水平明显降低。结论:知母宁有抗乙肝病毒的作用,其机制可能与抑制HBV-DNA的复制有关。

关键词:知母宁;乙肝病毒;2.2.15细胞;DHBV-DNA

乙型肝炎为常见病、多发病,据统计我国已约有一半以上人口经受HBV感染[1]。目前对乙肝的治疗多采取综合疗法,其中抗病毒治疗是主攻方向,但是到目前为止已发现的抗HBV药物疗效难尽人意。知母宁(Chinonin)是从多种植物中提取出的一种四羟基吡酮的碳糖苷,属双苯吡酮类化合物。前期的研究表明Chinonin有抗脂质过氧化作用、抗疱疹病毒作用等[2~3]。有研究认为民间用来治疗肝炎的藏茵陈的有效成分为Chinonin[4]。为了进一步深入研究Chinonin的生物活性及药理特性,我们开展了Chinonin抗乙肝病毒作用的体内外实验研究,以期筛选出新的高效低毒的抗HBV药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞、动物

2.2.15细胞由广州空军医院提供;1日龄华南麻鸭,由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 药品与试剂

Chinonin(三九药业生化研究所提供);DMEM(GIBCO);胎牛血清(GIBCO),G418(GIBCO),HEPES;MTT(SIGMA);DMSO(广州新港化工厂生产);HBeAg,HbsAg检测试剂盒(华美生物工程公司生产);DHBV质粒(中国医学科学院医药生物技术所生产);缺口翻译药盒(promega公司生产);α-32P-dCTP(北京亚辉公司生产);DHBV阳性血清。

1.1.3 实验仪器

细胞培养瓶、96W培养板、CO2培养箱(NAPCO 5410)、酶标仪(BIO-RAD:3550)、96孔杂交点样器(美国Bio-rad公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 2.2.15细胞培养

2.2.15细胞复苏后,以DMEM培养基培养于细胞瓶中,长满后,用0.06%的胰蛋白酶消化2min~3min,弃消化液,加少量DMEM培养液轻轻吹打,制成3×105/mL单个细胞悬液,种于96孔细胞培养板中,每孔0.1mL,37℃,5%CO2,48 h,细胞贴壁后用于实验。

1.2.2 HBeAg和HBsAg测定

将Chinonin配成多个浓度(从16mg/mL浓度开始倍比稀释),加于已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中,0.1mL/孔,每浓度4孔;设无药细胞对照组4孔及空白对照组4孔,每孔加入0.1mL 2%DMEM。加药培养10d后,吸取培养液于另一96孔板中,即行HBeAg和HBsAg测定,用酶标仪以450nm波长测定OD值(了解抗原的分泌情况)。原96孔板中用MTT染色,每孔加0.4g/L MTT 0.1 mL,37 ℃,5% CO2孵育4 h,弃上清后加DMSO 0.1 mL溶解,然后以490 nm波长比色测定OD值(了解细胞存活情况)。

1.2.3 鸭乙肝模型的建立及给药

1d龄华南麻鸭,足静脉注射DHBV阳性血清,每只0.2mL,1w后足静脉取血,检测DHBV-DNA阳性者进行实验。将鸭随机分3组,模型组、Chinonin高剂量组(200mg/kg灌胃)、Chinonin低剂量组(100mg/kg灌胃)。

1.2.4 DHBV-DNA检测

分别在给药前及给药后5d、10d,停药后3d,用斑点杂交法检测DHBV-DNA。(1)探针的标记:DHBV-DNA探针标记采用缺口平移法,按Promego药盒说明书稍加改动进行。(2)斑点杂交:①点样:将硝酸纤维素膜用去离子水和10×SSC溶液各浸泡30min,室温晾干后点膜,40μL/样,真空抽滤;②变性:将膜分别置于变性液I10min,变性液II 10 min,变性液III 10 min,将变性后的膜室温晾干,置80℃烤箱中2h,烤干;③预杂交:将膜置3×SSC-0.1%SDS10mL中,65℃,30min,换10×Dendhart-0.1%SDS10mL中,65℃,4h或过夜;④杂交:弃预杂交液,于杂交袋中加入杂交液,封口后42℃,36h~48h;⑤洗膜,用医用X线胶片,-70℃感光5d后显影、定影。

1.2.5 计算公式及统计方法数据结果以(x±s)表示,组间均数比较采用t检验,以SPSS9.0统计软件处理,显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Chinonin对细胞的毒性作用

Chinonin浓度在16mg/mL、8mg/mL时对细胞的毒性较大,破坏率均>50%,而4mg/mL时毒性明显减弱,破坏率为24.03%,且破坏率随浓度的下降而下降。经计算,Chinonin的半数毒性浓度(TC50)为6.318。为排除药物对HBeAg、HBsAg的抑制作用是由于对细胞的毒性所致,故选择TC50以下的浓度来评价药效。当Chinonin浓度为4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL时与细胞对照组比较均无显著差异,提示这4个浓度对细胞没有明显的毒性作用。

2.2 Chinonin对抗原的抑制作用

Chinonin在浓度为16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL时对HBeAg均有较好的抑制作用,与细胞对照组比较,P<0.05。经计算,半数有效浓度(IC50)=3.322。而对于HBsAg,Chinonin的抑制作用不明显,难以观察到药物浓度梯度与抑制率之间的相关关系。

2.3 Chinonin的治疗指数(TI)

Chinonin对细胞的半数毒性浓度(TC50)=6.318,抑制抗原分泌HBeAg的半数有效浓度(IC50)=3.322,其治疗指数(TI)=1.902。

2.4 Chinonin对鸭乙肝模型DHBV-DNA的抑制作用

鸭乙肝模型经Chinonin治疗后,DHBV-DNA水平均有不同程度的降低。其中Chinonin高剂量组在治疗10 d后,DHBV-DNA OD值较模型组显著降低,P<0.05,停药3d后,即使DHBV-DNAOD值有上升,但与模型组比较仍有显著差异。Chinonin低剂量组DHBV-DNAOD值也有降低的趋势。

3 讨论

本实验采用的2.2.15细胞模型及鸭乙肝模型均是研究抗肝炎病毒药物常用的方法。2.2.15细胞是乙型肝炎病毒基因组转染的人肝癌细胞HepG2系,其染色体内整合有HBV全基因,可表达乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),并可分泌有感染性的乙肝病毒颗粒,故2.2.15细胞常用作抗HBV药物最初的体外筛选模型。鸭乙型肝炎病毒与乙型肝炎病毒同属嗜肝病毒科,两者在毒粒形态、结构、基因组成、复制及传播方式等方面均很相似。DHBV是研究HBV复制机制及筛选抗肝炎病毒药物的常用模型。本实验结合体内外实验来观察Chinonin的抗乙肝药效及作用机理,实验结果显示,Chinonin对2.2.15细胞分泌的HBeAg有较好的抑制作用,对DHBV-DNA也有清除作用。这提示Chinonin抑制抗原的分泌可能是通过抑制HBV-DNA的复制和病毒的表达来起作用的。

实验中TI可用来评价药物临床应用前景,其中TI>2为有效低毒,1

此外,实验中Chinonin对HBeAg有较好的抑制作用,而对HBsAg没有明显的抑制作用,这在一定程度上可解释临床为何HBeAg的阴转较HBsAg的阴转容易,这是由于两抗原的表达存在不同的调控机制,至于其具体的机制尚需进一步的研究。

参考文献

[1]骆抗先. 乙型肝炎基础和临床[M]. 北京:人民卫生出版社,1997:2-3.

[2]黄华艺,钟鸣,孟刚,等. 芒果甙对大鼠血液过氧化脂质代谢的影响[J]. 中国中医药科技,1999,6(2):133-135.

[3]郑民实,陆仲毅. 芒果甙与异芒果甙的抗单纯疱疹病毒作用[J]. 中国药理学报,1989,10(1):85-90.

[4]丁经业,孙洪发. 藏茵陈抗肝炎有效成分的研究[J].中草药,1980,11(9):391-392.