猪肝组织核酸的分离纯化及鉴定

周之超　　石明明

摘要:利用盐溶法分离制备动物基因组DNA和RNA的方法,并对实验过程进行改良和分析。实验中选用新鲜猪肝作为实验材料,根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离,利用SDS裂解,氯仿、异戊醇抽提,分离得到猪肝脏中基因组DNA和RNA;同时,通过脱氧核糖和核糖的显色反应定性区分了DNA和RNA;实验最后利用紫外分光光度法和二苯胺法定量测定了DNA样品中的DNA的含量。

关键词:核酸;DNA;RNA;地衣酚显色法;二苯胺显色法

中图分类号:Q503;Q52文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)08-0007-03

核酸通常与蛋白质结合形成核蛋白存在于细胞中,是生命的基本物质之一,具有储存、传递生物体遗传信息的功能,也是蛋白质合成不可缺少的物质,在生物的生长、遗传、变异等生命过程中起着重要的决定作用。核酸分为两大类—核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。

核酸的基本组成单位是核苷酸,是由众多的核苷酸缩合而成的多聚核苷酸。核苷酸经过水解可以得到含氮碱、戊糖和磷酸。

真核生物基因组DNA和RNA广泛应用在动、植物的遗传育种基因图谱的构建、品种鉴定、物种形成和系统演化等方面的研究中,无论是基因工程,还是蛋白质工程,核酸分子都是这些技术应用所涉及的主要对象,所以DNA和RNA的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技术[1]。

1材料和方法

1.1材料

供试材料为冷冻的新鲜剪碎猪肝4g[2]。所用试剂为SC缓冲溶液:2.94g柠檬酸钠和9.0g氯化钠溶于1L蒸馏水(用盐酸调pH值至7.0);5% SDS溶液;地衣酚试剂:先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前以此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液;氯化钠;95%冷乙醇;氯仿;异戊醇。

1.2猪肝DNA和RNA的提取

1.2.1DNA的提取①取新鲜猪肝捣碎液,装入离心管,平衡,4 000r/min离心10min,除去上层;②下层加入SC溶液5mL混匀,同上离心,除去上层;③下层沉淀转移入三角瓶,加入SC溶液20mL,SDS溶液3mL混匀,5mL氯仿/异戊醇混匀,固体氯化钠2g边加边混,充分振荡30min,4 000r/min离心20min;④小心取出离心管,观察有3层,取出上层水相;水相加入等体积氯仿/异戊醇振荡10min,4 000r/min离心20min;⑤取上清,加等体积95%冷乙醇,边加边顺一个方向搅,玻璃棒上缠绕的DNA用少量80%乙醇洗一次,置小离心管于4℃冰箱中待用[3,4]。

1.2.2RNA的粗提①接上面的第一步,在上清中加入等体积的氯仿/异戊醇置于带塞烧瓶中振荡,冰浴30min;②将混合物转移至1.5mL EP管中,4℃、12 000r/min离心15min,将上清液移至另一EP管中;加异丙醇,在冰上放置15min,

3 000r/min离心10min,得到RNA沉淀[5,6]。

1.3核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色

D-核糖核酸+浓盐酸+地衣酚——反应显绿色

D-2-脱氧核糖核酸+酸+二苯胺——反应显蓝紫色

1.3.1 DNA显色1mL SC溶液溶解DNA,然后转移到50mL离心管中,用9mL 0.01mol/L NaOH溶液溶解,4 000r/min离心10min,上清转移到试管中备用。各取上述1mL DNA溶液于两只试管中,其中一只里面加入3mL地衣酚试剂,然后置沸水中20min,观察颜色反应;另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂,60℃条件下反应1h,观察颜色反应。

1.3.2RNA显色将RNA沉淀用2mL蒸馏水溶解,然后转移至2只试管中,每只1mL。其中一只试管中加入3mL地衣酚试剂,然后置沸水中20min,观察颜色反应;另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂,60℃条件下反应1h,观察颜色反应。

1.4核酸的定量和纯度测定

紫外分光光度法(此法要求核酸纯度很高,1个吸光度值相当于50μg/mL双螺旋DNA;除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测,A260/A280比值,纯的DNA为1.8,RNA为2.0,样品中含有蛋白质和苯酚时,A260/A280比值降低。);定糖法(DNA糖部分为脱氧核糖,RNA糖部分为核糖,分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法);定磷法(核酸的磷酸部分)。

1.4.1二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂,生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸,而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖,与二苯胺试剂反应生成蓝色物质,在595nm波长处有最大吸收(见图1)[5]。DNA在40～400μg范围内,光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。

1.4.2 DNA吸光度的测定①A260测定:以H2O作为空白,取上清测A260值后确定稀释倍数,使A260值在2.0左右(DNA此时的浓度约为100μg/mL。(由于二苯胺法的测定范围是40~400μg/mL DNA,所以DNA浓度如果太小会影响测定结果)。②A280测定:A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8,RNA为2.0。如果样品中混有RNA,则比值大于1.8;如果样品中混有蛋白质,则比值小于1.8。

所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。

1.4.3DNA标准曲线的制作和样品测定DNA标准曲线的制作加样见表1。

按表1加完各试剂后,充分混匀。于60℃水浴中保温1h,冷却后于595nm波长处以0管为空白调零,测定各管光密度(OD595)。以DNA的含量为横坐标,光密度(吸收值)为纵坐标,绘制标准曲线。(注:待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。)

1.4.4DNA含量计算 以样品的光密度,根据标准曲线计算出相对应DNA含量,并同紫外法测定的值进行比较。(注:二苯胺试剂具有腐蚀性,且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色,操作中应防止洒出;比色时,比色杯外面一定要擦干净。)

2结果与分析

2.1猪肝DNA及RNA的分离提取

2.1.1核酸分离的原则核酸存在于多种细胞,因此,分离方法复杂多样。因各种DNA、RNA含量的差异、核酸的纯度及量的要求不同,因此,在实验前应对所采用的方法有所选择。总的说来,核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上,利用苯酚等有机溶剂抽提(核酸溶于缓冲液,即水相),分离,纯化;利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀,收获核酸。

2.1.2DNA和RNA分离的基本原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离,然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白,使核酸释放出来,再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出,达到分离DNA和RNA的目的。

在0.14mol/L的氯化钠溶液中,RNA核蛋白溶解度大,而DNA核蛋白溶解度小;相反在1mol/L的氯化钠溶液中,DNA核蛋白的溶解度大,而RNA核蛋白的溶解度小,从而使DNA和RNA核蛋白分开。

2.1.3核酸分离的一般步骤①溶解细胞:溶解细胞的方法包括十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)加NaOH、蛋白酶和用超声波破碎等方法。②有机溶剂抽提:利用SDS溶液提取的目的是使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的。③沉淀:为了除去分离过程中残留的有机溶剂,常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸,再通过离心回收核酸,然后用80%乙醇洗涤沉淀,除去多余的盐,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。试剂盒:目前开发了许多商品化的核酸分离柱,可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA,其分离原理有的是利用核酸的分子量差异,有的是利用所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的目的。④传统的酚、氯仿、异戊醇在抽提中的作用:a.酚:有效的使蛋白质变性,不能完全的抑制RNA酶的活性,能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH>7.8,以防止DNA分配到有机相。结晶酚要在182℃下重蒸去除醌类等氧化产物,这些物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。b.氯仿:纯酚的比重为1.07,有机相和水相有时很难分开。加入氯仿(比重为1.47)可以避免这一问题。同时,酚有时会微溶于水。可以用氯仿将水相中的酚去除。c.异戊醇:减少泡沫的产生。

2.2核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色实验

DNA脱氧核糖的显色反应中加地衣酚试剂的试管反应后呈茶色,加二苯胺试剂的试管反应后呈蓝色。反应机理是DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解,产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ酮基戊醛,后者与二苯胺试剂反应成蓝色化合物,其反应为:DNA→ω-羟基-γ酮基戊醛→蓝色复合物,所以我们的结果与理论是一致的,对于加入地衣酚的试管,我们认为地衣酚主要是与RNA发生反应,所以我们看到的茶色可能只是地衣酚加热后的颜色,或者是DNA溶液和地衣酚加热后的共同的颜色。

RNA核糖的显色实验结果表明加地衣酚试剂的试管反应后呈浅绿色,加二苯胺试剂的试管反应后呈黑色。RNA与浓盐酸共热时发生降解,产生的核糖又可转变糖醛,在FeCl3或CuCl2催化下,糖醛与3,5-二羟基甲苯(地衣酚、苔黑酚)反应形成绿色复合物,实验结果观察到为浅绿色,符合理论结果,颜色稍浅,可能是浓度过低,试液被稀释的结果,或者是酸度不够没有加催化剂的影响。对于加入二苯胺试剂的试管,我们认为二苯胺试剂主要是与DNA发生反应,所以我们看到的黑色可能只是二苯胺试剂加热后的颜色。

2.3核酸的定量和纯度测定

2.3.1DNA标准曲线的制作和样品测定按照表1的顺序加入样品反应得到DNA标准曲线样品测定的结果(见表2),以DNA的含量为横坐标,光密度(吸收值)为纵坐标,绘制标准曲线(见图2)。

2.3.2DNA含量的计算由图2所作的DNA标准曲线可知,DNA含量与OD595的关系为:

OD595=0.0022×c(DNA)浓度

实验中样品1为DNA原液,样品2为稀释1倍的DNA溶液。将OD595值0.274和0.174分别代入上面的公式,可求得样品1、样品2中的DNA含量分别为124.54μg/mL和79.09μg/mL。由紫外分光光度法得,1个吸光度值相当于50μg/mL双螺旋DNA,我们测得稀释一倍的DNA溶液吸光度值为1.734,所以其DNA含量为50μg/mL×1.734=86.7μg/mL,则原液DNA含量为86.7μg/mL×2=172.4μg/mL。

由实验结果得知,通过DNA标准曲线测得的DNA含量比紫外分光光度法测得的值要低,由于而在我们的实验过程中很难保证这一点,所以我们认为通过DNA标准曲线测得的DNA含量值更为可信。而且,紫外分光光度法对核酸纯度要求很高,但测得的A260/A280比值为1.727,纯的DNA为1.8,说明样品中混入了蛋白质,可能是在DNA的分离纯化中,没有将蛋白质除尽的缘故。

3讨论

(1)在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物而存在——核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白。核蛋白在水溶液和各种电解质溶液中有一定的溶解度,所以在前面研磨步骤将损失一部分核酸。因此应避免加入大量的水进行研磨,以减少核蛋白的溶解。

(2)核酸酶降解核酸所带来的误差。脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在导致了一些核酸降解成为了核苷酸,在水中溶解后被弃去。防止该误差的主要方法有两种,一是选取核酸酶含量较低的材料,如小牛胸腺细胞等;二是降低酶活性,保证操作在低温下进行,以此来抑制酶的活性。

(3)在碱性溶液中溶解RNA后加HCl时,溶液呈酸性,有小部分DNA此时也被水解掉了。可以之前利用氯仿-异戊醇法或苯酚法去除蛋白质,然后在溶解RNA后就可以直接把上清液分离出来。

地衣酚法测RNA反应原理是:当RNA与浓盐酸共热时.即发生降解.形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe2+或Cu2+催化下,成鲜绿色复合物,反应产物在670nm处有最大吸收。所以,地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,己糖持续加热产生的羟甲基糠醛,以及DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。另外,RNA浓度在10~100μg/mL范围内,光吸收与RNA浓度成正比,其中所用标准液浓度为100μg/mL,笔者认为采用50μg/mL,RNA待测液浓度再稀释一倍,所测结果再利用线性关系计算会更准确些[4]。

(4)提取基因组DNA要保证其一级结构的完整性,排除其他生物大分子(蛋白质、多糖、脂类等)以及RNA分子的污染,并且不存在过高浓度的有机溶剂和金属离子,以避免化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏和对后续的酶反应产生抑制作用;同时,应尽量简化操作步骤,以减少提取过程中有害因素对核酸的破坏。该试验使用SDS破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,有效去除核酸分子结合的蛋白质,从而游离出核酸,它主要用来抑制核酸酶的活性,避免DNA被降解;加入氯仿也是为了使核蛋白变性,促使DNA分子释放,有效抑制核酸酶活性,去除带有poly(A)长链的RNA。该试验所用试剂均为常见的化学试剂,不需要昂贵的生物试剂;试验仪器要求低,操作简单,完成一次提取过程仅需5～6h[1]。

参考文献:

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[2]夏艳萍,贺捷,库热西·玉素甫. 组织DNA分离、纯化与鉴定的质控和优化[J]. 新疆医科大学学报,2005(4):376.

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[4]萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南第2版.[M].北京科学出版社,1995. 463-469,921-963.

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