分子杂交技术的应用简述

黄凤珍

核酸分子杂交技术是利用DNA变性与复性的原理，在某种理化因素作用下DNA双链分子解链变性后，在DNA复性重新形成双螺旋结构时，把不同的DNA单链分子或者DNA与RNA的混合物放在同一溶液中，只要在DNA或RNA单链分子之间存在一定的碱基互补配对关系，就可以在DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化的双链。蛋白质分子杂交是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。分子杂交技术有很多种，下面重点介绍三种常用的分子杂交技术的基本流程和应用。

1Southern杂交——DNA和DNA分子之间的杂交

1.1基本流程

第一步，从组织或细胞中提取出DNA，经过适当的限制酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；

第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；

第三步，用标记了放射性同位素(或生物素)的目的基因的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；

第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；

第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明待测样品中含有目的基因。

1.2具体应用

Southern杂交主要用来研究DNA分子中某一基因位置、某一专一序列在待检样品中存在与否及两种核酸分子之间的相似性。具体来说，此项分子杂交的应用有以下几点。

1.2.1用于对基因组中特定基因的定位及检测

如基因工程中用于检测目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中。这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。

1.2.2用于从基因文库中找到所需要的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，构建了该种生物的基因文库，但如何从基因文库中找到所需要的基因呢?具体做法如下。

第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，制成探针。

第二步，将基因文库中的所有菌落转移到硝酸纤维素膜上，然后通过处理，溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。

第三步，按Southem杂交的方法进行杂交。

第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落含有所需要的目的基因(若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因)。

第五步，从该菌落中再提取目的基因。

1.2.3用于基因诊断遗传病、癌症等

举两个常见的病例：

镰刀型细胞贫血症是β－珠蛋白基因第六个密码子发生单个碱基突变(A-T)，这一突变使该基因内部一个MstⅡ限制酶位点丢失。因此，将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA用MstⅡ切割后，与β—珠蛋白基因探针杂交，即可将正常人、突变基因携带者及镰刀型细胞症患者区别开来，如图1所示。

苯丙酮尿症(PKU)是新生儿中发病率较高的一种遗传病，如果用限制性内切酶EcoRV酶解苯丙酮尿症患儿及其父母的DNA，再与苯丙氨酸羟化酶基因探针杂交，分析杂交片段后就会发现其父母都具有30 kb／25 kb酶特异片段，患儿则具有30 kb／30 kb片段。这说明患儿的2条30 kb片段都与致病基因连锁，分别从父母亲处遗传而来，而父母亲另一条染色体的25 kb不与致病基因连锁。在此基础上，分析另一未知胎儿，如果杂交图谱显示30 kb／25 kb特异片段，就可诊断胎儿为杂合子，如果杂交图谱显示为30 kb／30 kb片段，即为患儿。

2Northern杂交——DNA和RNA分子之间的杂交

2.1基本流程

与Southern杂交相同，只是第一步从组织或细胞中提取的是mRNA而不是DNA，另外由于RNA分子较小，在转移前无需进行限制酶切割。

2.2具体应用

目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异性mRNA的表达水平或比较不同组织或细胞中同一基因的表达情况，如在基因工程中是检测目的基因是否转录出mRNA的方法。

如果RNA分子在大小和含量上与正常情况不同，可以考虑是否有调控区的突变或剪接部分的突变。

3Western杂交——蛋白质分子(抗原－抗体)之间的杂交。

3.1基本流程

以检测目的基因在受体细胞中是否表达出相应的蛋白质为例，其具体做法是：

第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；

第二步，将表达出的蛋白质注射给动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体(一抗)；

第三步，从转基因生物中提取蛋白质，进行凝胶电泳；

第四步，将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上；

第五步，将抗体(一抗)与硝酸纤维素膜上的蛋白质杂交，这时抗体(一抗)与目的基因表达的蛋白(抗原)会特异结合。由于这种抗原－抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

Western杂交与上述两种杂交技术不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成。另外蛋白质的检测是以抗体而不是以核酸作探针。上述三种杂交技术都需要将存在于凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质上并加以分析，称为印迹技术。基本流程可用图2归纳。

3.2具体应用

可用于检测样品中特异蛋白质是否存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。如检测目的基因在受体细胞中有没有翻译出相应的蛋白质，检测病人血液中是否有某种抗体从而检测是否感染过某种抗原，单克隆抗体技术中用于筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞等。