拮抗草莓灰霉病菌的内生细菌SL2的分离及鉴定

李 娜

摘要从草莓健康叶片中分离到27株内生细菌,与草莓灰霉病菌的对峙试验测定结果表明,其中有3株对草莓灰霉病菌具有显著拮抗作用。且SL2的抑菌效果最为明显,其抑菌半径达到14mm,通过对其进行形态、生理生化特性及16S rDNA序列等方面的研究,初步鉴定SL2为地衣芽孢杆菌。

关键词内生细菌;草莓灰霉病菌;地衣芽孢杆菌;16S rDNA

中图分类号 Q93-331 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)21-0296-01

内生菌存在于健康植株中,能够通过占据有利的生态位点来防止病原菌的入侵[1],并兼具克服附生细菌定植能力差、防效不稳定等特点,因此具有拮抗作用的内生菌是生物防治的潜在资源[2]。草莓灰霉病发生在草莓的开花后期和采收期,严重危害到其产量和质量[3],虽然使用化学农药能够减轻这种危害,但其造成的环境污染及果实中农药残留超标等副作用也日益引起人们的关注。因此,分离筛选有拮抗作用的内生细菌对防治草莓灰霉病有极其重要的意义。

1材料与方法

1.1供试材料

供试病原菌为草莓灰霉病菌。内生细菌分离,从草莓基地采集草莓叶片,经严格的表面消毒,组织匀浆后稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,37℃培养3～5d。挑取大小、颜色、形态不同的菌落,纯化得单菌落。

1.2拮抗菌的筛选

采用对峙培养法,取直径为8mm的病原菌饼置于PDA平板(Φ90mm)中央,用接种环挑取纯化好的菌种点接在距平板中央3cm处的4个角点上,25℃培养7d后测量抑菌带宽。每处理设3个重复。选出对病原菌生长有抑制作用,且被抑病原菌丝边缘平齐、拮抗作用持久的菌株。

1.3拮抗菌的形态及生理生化鉴定

拮抗细菌的形态、培养性状和生理生化特性测定参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册鉴定》[4,5]。

1.416S rDNA 的PCR扩增和序列分析

抽提拮抗菌总DNA,利用16S rDNA 细菌通用引物16SR1 (AGAAAGGAGGTGATCCAGCC);16SF1(AGAGTT TGA-TCC TGGCTCAG)进行PCR 扩增。扩增产物回收,送至上海生工生物科技公司测序。测序结果用Blast软件在GenBank中进行同源性比较。

2结果与分析

2.1内生菌拮抗活性

从草莓叶片中共分得27株细菌,其中3株有拮抗活性,SL2有明显的抑菌带(见图1)。抑菌半径达14mm。

2.2拮抗内生细菌的形态特征和生理生化特性

SL2菌株形态特征:浅黄色、不规则、边缘皱缩、不透明;革兰氏染色呈阳性、杆菌i;有芽孢。SL2菌株生理生化特性见表1。

2.3菌株SL2的16S rDNA序列分析

菌株SL2的16S rDNA PCR产物长度为1 100bp,用ClustalX程序对菌株SL2的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行比对分析,结果发现,SL2与acillus licheniformis strain CICC 10181(GQ375235)序列相似度达99%,结合生理生化鉴定结果,可初步鉴定菌株SL2为地衣芽孢杆菌。

3结论与讨论

据报道,从植物体内分离筛选到的内生细菌多具有防病、促生等作用,可用于生防制剂的开发应用[2,6]。试验从草莓叶片中分离具有较高拮抗作用的地衣芽孢杆菌SL2,具有生防菌株的潜力,但对其作用机制还有待进一步的研究,以期能为生物防治获得较好的活性物质。

4参考文献

[1] HALLMANN J,QUADT-HALLMANN W F,MAHAFFEE A,et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J].Can J Microbiol,1997,(43):895-914.

[2] 何红,蔡学清,洪永聪,等.辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[J].中国生物防治,2002,18(4):171-175.

[3] FARVIS W R. The Biology of Botrytis[M].Academic Press,1980.

[4] BUCHANAN RE,GIBBONS N E.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:科学出版社,1984.

[5] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[6] 袁军,孙福在,田宏先,等.防治马铃薯环腐病有益内生细菌的分离和筛选[J].微生物学报,2002,42(3):270-274.