植物生物反应器生产口服疫苗的研究进展

及晓宇 于丽杰

摘要随着基因工程技术的快速发展、植物转基因技术的日趋成熟,植物已成为基因重组生物制品的重要表达载体。利用转基因技术构建植物生物反应器生产口服疫苗是目前新兴的研究领域。综述了亚单位抗原在转基因植物中的表达系统、转基因植物生产的重组疫苗、转基因植物疫苗存在的问题及解决方法等,并展望了其研究趋势和应用前景。

关键词植物生物反应器;口服疫苗;转基因植物

中图分类号Q946.1;R282.71文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)08-0210-02

随着分子生物学技术的发展,植物生物反应器生产口服疫苗的研究异常活跃。从1983年首次获得转基因植物至今,植物基因工程的研究取得了飞速的发展。以转基因植物作为生物反应器来生产药用蛋白,如抗体、疫苗等也成为国际上植物基因工程一个新的发展趋势。迄今为止,在转基因植物中表达的抗原基因约有20多种,随着研究的深入,转基因植物疫苗以其可食性、廉价性,成为应用广泛而有发展潜力的疫苗。

1植物生产口服疫苗的不同表达系统

利用植物生物反应器生产口服疫苗的过程包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培养与植株再生、转化植株的栽培、目标产品分离纯化与纯度鉴定等。其载体表达系统为:稳定表达系统与瞬时表达系统。

1.1稳定表达系统

稳定转化是将目的基因整合到转基因植物的核基因组或叶绿体基因组中,能够稳定表达目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。

1.1.1核表达系统。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaci-ens)介导。农杆菌Ti质粒中含一段T-DNA,能与植物核基因组DNA发生同源重组,在T-DNA两侧插入外源基因,外源基因就能与T-DNA一起随机整合到植物核基因组中。Mason等将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因转入马铃薯中并获得表达,并用薯块饲养小鼠,在小鼠体内检测到保护性抗原包括黏膜抗体,以抵御细菌的侵染。另外,在一些农业经济作物中,如大豆、水稻等不易进行农杆菌转化,在这类植物中,基因枪法被广泛应用,外源基因可能整合到植物核基因组中。与农杆菌法相比,基因枪法具有更高的整合率。

1.1.2叶绿体表达系统。用基因枪法把外源基因打入叶绿体中,外源基因可能在叶绿体中整合。叶绿体转化体系只应用于几种植物,但是叶绿体的基因拷贝数很多,利于增强目的蛋白的表达量,具有很大的潜力;叶绿体基因是严格的母系遗传,可避免植物传粉过程中的基因污染,而且不会出现基因沉默问题。

1.2瞬时表达系统

通过整合外源基因的重组病毒感染植物,外源基因随病毒的复制而得到高水平的表达,这样的植物就成了生产疫苗的“绿色工厂”。最常用的2种宿主:病毒表达系统是烟草和烟草花叶病毒(TMV)及豇豆和豇豆花叶病毒(CPMV)。瞬时表达系统病毒复制拷贝数多可提高表达量。然而,病毒表达系统不稳定,外源基因容易丢失。此外,每株植物都要接种病毒,大大增加了工作量。

2植物生产口服疫苗的研究现状

2.1植物生物反应器生产口服疫苗的优势

除了转基因植物,能够生产重组疫苗的系统有细菌、酵母、动物病毒、植物病毒和转基因动物等。植物表达系统与上述疫苗生产系统相比,具有较大的优势。植物生物反应器具有如下优点:一是植物生产系统具有廉价性。植物表达系统最吸引人之处是它能廉价地生产高价值、供不应求的蛋白。在获得转基因阳性植株后,生产转基因口服疫苗工艺简单,不需要昂贵的培养基和复杂的纯化过程,也不需要严格的无菌生产和冷藏保存,只需增加耕种面积就能扩大其产量并易于栽培管理。二是植物细胞的全能性。植物的组织培养、细胞或者原生质体在适当培养条件下均能再生出完整的植物个体。药用基因转化到植物细胞后可培育出药用植物品种,并可稳定遗传。三是安全性。动物细胞生产转基因疫苗,常用动物病毒作为载体导入抗原基因,生产过程可能被动物病毒污染,这些病毒对人类健康具有潜在的危害性。而在植物中,外源蛋白的生产或通过重组植物病毒载体的侵染,或通过外源基因稳定地整合进植物基因组中来实现,避免了转基因动物带来的伦理问题。植物病毒不能感染人类,表达产物无毒性和副作用,安全可靠,无残存DNA和潜在的致病性、致癌性。四是植物具有完整的真核细胞表达系统。表达产物可糖基化、酰胺化、磷酸化,可完成对亚基的正确装配等翻译后加工过程,使表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性。

2.2利用转基因植物生产的重组疫苗

从20世纪90年代初提出口服疫苗的概念,利用转基因植物生产人口服疫苗就成为研究热点。表1为2000~2007年利用植物生物反应器生产的重组疫苗和药用蛋白。

3转基因植物疫苗存在的问题和解决方法

利用转基因植物生产口服疫苗是近10年的事情,尽管利用转基因植物生产疫苗有很多优点,但就目前的技术而言,仍然存在一些急需解决的问题,主要表现为以下几点。

3.1重组蛋白的表达问题

重组蛋白的表达量低,表达效率不稳定,在已报道的研究中,外源基因所表达的重组抗原蛋白,大约只占植物可溶蛋白的0.01%~0.37%。为使外源抗原基因更好地在植物中高水平表达,可对目的基因进行修饰,如优化密码子、优化抗原表位、添加增强子,或前导序列、添加修饰基因或吸附基因使抗原直接靶向免疫系统等;为消除目的基因转化后的沉默现象,在构建表达载体时,尽量降低目的基因与植物基因组的同源性,对多基因结构采取不同的启动子和polyA序列,或在转基因的侧翼接上核基质结合序列以避免位置效应;选组织用强启动子如来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子,可增强目的蛋白在叶片中的表达水平;选用组织特异性启动子,如番茄果实特异性启动子、马铃薯块茎启动子等,可使目的蛋白在植物的特定部位集中表达。

3.2用于口服时易被消化及作用机理问题

转基因植物疫苗是在植物体内表达的亚单位疫苗,生物安全性高,不需要注射,在人们享用美食的同时就得到了免疫,并排除了繁琐的疫苗纯化过程。但这种亚单位疫苗没有减毒活疫苗免疫性强,需要加强免疫来提高免疫应答的水平;另外,消化系统会降解抗原,因此,要求转基因植物疫苗具有肠稳定性和形成荚膜包被的抗原。细胞壁是阻止抗原被降解的第1道屏障,植物细胞膜可进一步保护抗原避免胃液、肠液的降解作用,植物细胞的次生壁可以使内含物释放更慢,直到达到小肠内植物细胞壁才开始破裂逐步释放抗原,从而实现免疫功能,但仍需要对其中的细节问题进行研究。另外,也可采取在抗原基因上附加修饰基因或吸附基因序列,保护口服疫苗不易被迅速消化,使之长时间地停留在消化系统内。

3.3口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题

动物实验表明,口服疫苗涉及到口服耐性问题。口服疫苗也有可能导致人和动物产生口服耐性,从而不再对疫苗抗原产生免疫反应,致使疫苗失去作用。必须研究口服疫苗的安全性、有效剂量和服用时间表,必须确定口服疫苗是起刺激作用还是抑制作用。

3.4植物疫苗的生物安全性问题

转基因植物的生物安全性问题一直是近年来争论的焦点。外源基因是否会漂到环境中而破坏环境;抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因;长期使用这类转基因是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效;转基因植物中新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物,引起菌群和数量的变化或插入并表达,从而危害人畜健康。这些问题目前都无法解答,仍需要大量学者研究证实。

4利用植物生产口服疫苗前景展望

用转基因植物生物反应器生产有医疗价值的抗体、疫苗及一些重要药用蛋白,具有一定的优势和良好的前景。转基因植物口服疫苗优势突出,具有极大的潜力,20多年来,植物疫苗的研究取得了很大的进展。目前,美国DowAgros-cience公司开发用于预防禽类的NEWCASTLE Concent成为第1个获得美国农业部兽用生物制品中心批准的兽用植物疫苗,极大地促进了人用植物疫苗的研究与开发。随着人类基因组计划的逐渐深入,相信不久的将来,人们将会发现更多的有医疗作用的蛋白,植物疫苗将广泛地用于人类疾病的预防。

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