转基因技术在水稻性状改良中的应用进展

王利红　尹西翔　徐清忠　李赛钰

摘要综述了水稻转基因技术的发展、转基因技术在水稻中的应用以及外源基因在水稻中的遗传和鉴定，以期将转基因技术应用到环境科学领域，生产出安全无污染的稻米。

关键词水稻；转基因技术；性状改良

中图分类号 Q812 文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）06-0131-02

世界上有超过30%的人口以稻米为主食，随着世界人口的增加，对稻米的需求逐渐增加。据统计，未来25年粮食产量必须增加60% 才可满足人口增长的需要[1]。世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战。因此，迫切需要采取措施增加水稻等农作物的产量。

随着分子生物学研究的不断发展，转基因技术在植物遗传育种和品种改良上得到了广泛应用。自20世纪人类首次获得可育的转基因水稻以来，转基因技术在水稻品种改良上得到了广泛应用[2]。该文综述了近年来水稻转基因技术的发展、应用进程。

1水稻基因转化方法

基因转化的方法可分为2类：一是由载体介导的转化，主要的方法为农杆菌介导法；另一类是直接的基因转化，包括基因枪法、电击法、PEG法、脂质体转化法和花粉管通道法[3,4]。近年来，应用较多的为农杆菌介导法和基因枪法。

1.1农杆菌介导法

农杆菌介导转化法是将外源基因插入农杆菌的质粒上，由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中去。农杆菌介导法在水稻上的遗传转化研究最早始于1986年，Baba等用PEG促进农杆菌原生质球与水稻原生质体融合的方法获得了水稻愈伤组织，但未获得转基因植株[5]。随后，Raineri等（1990）用粳稻的成熟胚与农杆菌共同培养获得了转基因愈伤组织，Southern分析表明，T-DNA已整合入基因组中，但未再生出转基因植株[6]。Chan等首次报道用农杆菌转化水稻根系外植体（1992）和未成熟幼胚（1993）得到可育转基因水稻，Southern blot分析表明，T-DNA上的基因可传递给后代[7，8]。Hiei等（1994）利用“超级-二元载体”首次实现对粳稻的高频转化，得到大量转基因植株，使农杆菌介导转化水稻获得了突破[3]。农杆菌介导法转化方法简单、转化效率高；再生植株可育率高；可转入较大片段外源DNA；转入基因的拷贝数少，大大降低了同源抑制产生的基因沉默机率[9，10]。

1.2基因枪法

基因枪转化法是利用火药、高压气体或高压放电为动力，将包被有外源基因的颗粒通过基因枪高速轰击组织或细胞，使外源基因整合到细胞基因组内。基因枪转化的最大优点是转化材料广泛，细胞、组织和器官均可用作转化而不受原生质体培养的限制，从而减小了对基因型的依赖性，这是它适用于水稻转化的主要原因[4]。目前，水稻转化中应用较多的转化材料有幼胚、胚性愈伤组织以及胚性悬浮细胞[9]。当前，基因枪法已成为水稻遗传转化的可靠途径。但基因枪法具有价格昂贵、转化频率偏低、导入的外源基因拷贝数高、在后代中容易丢失、对片段大的基因难以导入且嵌合体不易排除等缺点，需要进一步改进[10]。

1.3其他水稻基因转化方法

PEG转化法是禾谷类作物转化中最早应用的方法之一[11]。主要原理是利用化合物聚乙二醇（PEG）及高pH值条件诱导原生质体体外摄取外源DNA。原生质体作为受体具有群体数大、便于操作、DNA分子易于进入获得纯合转化子等优点，但原生质体培养难度大、再生频率低、周期长、不适合水稻转化研究。

电激法也是以原生质体为受体的转化方法[12]。其原理是利用短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜形成可逆的瞬间通道，使DNA进入细胞，其转化效率高于PEG法，但目前很少应用。

花粉管通道法是利用植物授粉后一段时间内，从珠孔到珠心之间有一条花粉管通道，外源基因可通过此管道进入胚囊并转化尚不具备正常壁的卵、合子或早期胚胎细胞，进而借助于天然的种胚系统形成转基因种胚。该方法机理尚不完全清楚，目前应用并不是很多[4]。

2转基因技术在水稻上的应用

2.1抗除草剂转基因水稻

抗除草剂基因工程是生物技术的一个重要领域，目前，抗除草剂转基因作物种植面积占转基因作物种植面积的比重较大[13]。Bar基因是抗除草剂基因之一，Christou等（1991）和Datta等（1992）将Bar基因转入水稻后，水稻可以抵抗大剂量的草丁磷[14，15]。转抗除草剂基因的成功不仅解决了直播稻的化学除草问题，而且解决了杂交稻制种纯度的关键问题。

2.2抗虫转基因水稻

目前，应用于水稻抗虫性状改良的外源基因主要有苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因（Bt基因）、昆虫蛋白酶抑制剂（PI基因）和植物凝集素基因3种，其中Bt基因如cryIA（b）、cryIA（c）是当前应用最广泛的杀虫基因[10]。Fujimoto等（1993）首次使用电激法将cry基因转入粳稻中，并发现转基因R2代幼苗抗虫性明显提高[16]。戴正元等（2007）以携带cryIA（b）基因的“克螟稻”为抗虫供体亲本，将目标基因转导到优良恢复系R6547、R818中，配制杂交稻组合表现良好的杂种优势水平[17]。

2.3抗病转基因水稻

水稻抗病基因工程包括抗病毒、抗细菌和抗真菌基因工程。现在许多重要的抗病基因如CP（抗水稻条纹病毒）、Xa21（抗枯萎病）、Pib（抗稻瘟病）、Cecropin B（抗菌肽基因）等基因已从植物或其他生物中分离克隆，并在水稻抗病转基因中作了大量研究，取得了显著成绩[4，10]。Wang等（1999）将Pib基因导入日本晴，得到了抗稻瘟病转基因水稻，将天蚕抗菌肽B基因Cecropin B导入粳稻秀水11和中花11中，转基因水稻植株对水稻白叶枯病和细条病的抗性都出现了不同程度的提高[18]。

2.4抗逆转基因水稻

现已证实，不利的天气和土壤等环境条件是影响稻谷产量和稻米品质的重要因素。Xu等（1996）将大麦后期胚胎富蛋白基因HVA1导入水稻，提高了水稻抗旱和抗盐的能力[19]。Yokoi等（1998）将拟南芥中的磷酸甘油转移酶基因（Gpat）转入水稻内，提高了水稻不饱和脂肪酸的含量和抗寒能力[20]。另外，一些和超氧自由基清除有关的基因被转入水稻，提高了水稻的抗逆能力。随着抗逆基因的大量克隆和转基因技术的进展，越来越多的抗逆基因被转入水稻中[9]。

2.5转基因技术在水稻品质改良上的应用

目前，很多研究者利用转基因技术对水稻的营养、食味品质进行了改良。美国Louisiana州立大学的研究人员Zheng等（1995）将菜豆种子蛋白质基因导入水稻中表达，使得转基因水稻种子总蛋白质含量增加4%，赖氨酸含量也有所提高[21]。高越峰等（2001）将从四棱豆中获得的高赖氨酸蛋白基因导入粳稻中花8号，并获得转基因植株，对转基因植株进行赖氨酸含量测定，结果表明，与非转化对照相比，有2棵植株赖氨酸含量分别增加6.0%和12.4%[22]。Goto等（1999）育成了1种籽粒富含铁蛋白的转基因水稻，这种转基因水稻的籽粒含有大豆铁蛋白基因的编码序列，这种水稻籽粒的含铁量相当于一般籽粒的3倍，食用这种“铁蛋白稻米”可为成年人提供每日13～15 mg需铁量的30%～50%[23]。李梅等（2008）在不同环境下研究了铁蛋白转基因水稻矿质积累情况，发现其具有更强的积累铁的能力[24]。

3外源基因在水稻中的表达与鉴定

3.1水稻中外源基因的表达

外源基因整合入目的植物的基因组后，其表达与稳定性和转基因的失活与沉默有关。外源基因整合进目的植物基因组后，易被植物基因组存在的修饰与限制系统所识别并加以修饰和抑制，使之失活和沉默。研究表明，DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。另外，共抑制与转基因失活有关。共抑制现象主要是由于外源基因重复，外源基因和内源基因编码区具有同源性或外源基因在强启动作用下，产生过量的同源转录本引起的[25]。

3.2水稻中外源基因的鉴定

利用转基因方法获得的转基因植株及其产生的后代，主要分以下几个层次鉴定：一是外源基因整合的鉴定，主要有Southern杂交和PCR法检测阳性。二是外源基因转录水平的鉴定，有Northern杂交和RT-PCR检测法。三是外源基因表达蛋白的检测，主要有3种：生化反应检测法、免疫学检测法、生物学活性的检测。四是报告基因的酶法检测，常用的报告基因有：gus、nos、ocs等[4，9]。最后转基因植株必须移栽于大田，进行田间鉴定，对改良性状和其他农艺性状进行评价。

4转基因水稻的环境安全问题

转入的基因本身是不会对水稻生长及环境带来危害，但转基因操作的过程可能导致受体基因组的变异；植物遗传转化中的筛选标记基因对人体无益，必须在转基因植物中有效去除；基因漂流可能使抗性基因转移到杂草中产生转基因杂草。科研工作者正逐渐关注转基因标记基因的有效去除以及转基因产生的超级杂草问题[9，26]，尽管人们担心转基因食物会对人体产生伤害，但转基因大米、大豆、棉花等已经产生，而且表现出了抗虫、抗病以及高产等优势。因此，人们必须用客观公正的眼光去看待它们。

5展望

当前调控重金属在植物体内代谢过程的关键基因逐渐被克隆，人们可以将转基因技术应用到水稻重金属污染调控过程中。利用基因转导的方式改变重金属在水稻中的含量及形态，降低其食用产生的人体健康风险。随着转基因水稻转导后标记基因的去除和安全性鉴定及人体健康风险评价工作的逐渐深入，转基因水稻的食用、环境安全性将得到解决。可以确信，转基因水稻将会以其独特的优势，使水稻品种不断得到优化和改良，将更快地适应社会的需求。

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