ＵＶＡ损伤人表皮细胞模型中载物界面的选择

马林琳　张　玲　罗　敏　邓杨林　李玛琳

【摘要】 目的 选择一种建立长波紫外线(ultrayiolet，UVA)照射人表皮角质形成细胞损伤模型的理想载物界面。方法 选取原代培养的处于指数生长期的角质形成细胞，分别采用泡沫板、锡纸板、冰面作为载物界面，进行相同剂量的UVA照射，同时设未照射组为对照组，通过改良MTT法检测细胞损伤程度。结果 冰面作为载物界面时，细胞损伤相对较弱，损伤率仅为19.88%；锡纸面作为载物界面时，细胞照射损伤最重，损伤率高达82.76%；泡沫板作为载物界面时的细胞照射损伤率为55.58%，介于上述两种载物界面之间，各组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论 泡沫板是UVA照射人表皮细胞损伤模型的理想载物界面。

【关键词】 UVA；人表皮角质形成细胞；模型；载物界面

Select a matter interface for the models of UVA induced human epiderm keratinocytes irradiation damage MA Lin-lin，ZHANG Ling，LUO Ming，et al.Kunming Medical College in Yunnan Province Key Laboratory of Pharmacology of Natural Medicines，Kunming，Yunnan 650031，China

【Abstract】 Objective To choose a better matter interface for the models of UVA induced human epiderm keratinocytes irradiation damage.Methods To irradiate the human epiderm keratinocytes with an identical dose of UVA，which is primary cultured and is occupying exponential growth phase.The matter interface is cystosepiment，tin foil and ice.The non- irradiation group is the control group.To detect the cells degree of injury through the improved methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay.Results The frequency of injury is 19.88% with the matter interface of ice，and cells injury is feeble.The injury rate is 82.76% with the matter interface of tin foil，and cells injury is heaviest.But the injury rate is 55.58% with the matter interface of cystosepiment，the cells injury is between the ice and the tin foil.To compared with the control group，each group have a significant difference (P<0.05).Conculusion To decided that the matter interface is the cystosepiment when the period of irradiation.

【Key words】 UVA；Human Epiderm Keratinocytes；model；matter interface

日光中的紫外线与皮肤晒伤、皮肤老化、皮肤炎症以及皮肤癌的发生发展有着密切的关系。近年来环境随着污染日益严重和臭氧层破坏的加剧，紫外线辐射日益增强。研究紫外线对人体皮肤的损伤及寻找抗紫外线损伤的保护产品，受到人们越来越多的关注。人表皮角质形成细胞(human epiderm keratinocytes，HEKC)UVA损伤模型的建立是研究紫外线损伤及开发防紫外线产品的基础和前提。

一个良好的细胞损伤模型应该具备细胞损伤程度适中、损伤可控以及用于实验研究具有良好的可重复性等特点。HEKC的UVA损伤模型是通过UVA辐照装置对HEKC进行照射而建立的。在建立该模型过程中受很多因素的影响，其中在采用UVA辐照装置对细胞进行损伤性照射时，必须使用一种承载细胞培养皿/板的装置(载物界面)。在已报道的多种光损伤模型中，使用的载物界面亦不同，如倪建华^[1]等采用干冰作为载物界面，王红伟^[2]等则以冰面为载物界面，还有人直接以超净工作台的金属台面为载物界面。不同的载物界面对光的吸收和反射作用不同，在UVA照射过程中会对其照射效果产生很大的影响。为使实验结果具有稳定性及可重复性，加之实验的经济性原则，本研究对几种载物界面对模型建立的影响进行比较，旨在为建立UVA照射HEKC损伤模型确定一种理想的载物界面，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 载物界面 泡沫板、锡纸板、冰面。

1.1.2 主要仪器及试剂 UVA光源以及紫外辐照度计(北京师范大学光学仪器厂)、眼科剪眼科镊等手术器械、温度计、DispaseⅡ(Sigma公司)、0.05% Trypsin-EDTA(GIBCO公司)、Keratinocyte-SFM(GIBCO公司)、PBS(国产分析纯试剂配制)、MTT(Sigma公司)、十二烷基硫酸钠(广州南方化玻公司分装)、异丁醇(上海试剂一厂)、盐酸(汕头市西陇化工厂)。

1.1.3 人角质形成细胞 健康男性环切术切除的包皮组织(昆明医学院第一附属医院)原代培养获得HEKC。

1.2 方法

1.2.1 人角质形成细胞的原代培养 将取得的皮肤标本，PBS液反复冲洗后，采用陈勇等^[3-5]报道的培养方法，原代培养获得HEKC。

1.2.2 实验分组 实验分为未照射组、分别以泡沫板、锡纸板及冰面作为载物界面的照射组。

1.2.3 细胞接种及处理 第3代HEKC，以细胞密度2×10⁴个/cm²接种到12个35 mm培养皿中(每组设3个培养皿)，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，HEKC生长至指数生长期时进行实验。弃去Keratinocyte-SFM，PBS液洗涤2次后，每孔加入适量PBS液，用于实验操作。

1.2.4 UVA照射 照射装置由六根平行的UVA灯管组成，通过紫外辐照度计确定照射强度为6.4 W/cm²，根据照射剂量8.09 J/cm²，确定照射时间为21 min。

将照射装置置于超净工作台内，分别采用泡沫板、锡纸板及冰面为载物界面对照射组HEKC进行照射(HEKC距灯管垂直距离为1 cm)，未照射组HEKC于超净台内放置相同时间后，同照射组HEKC一起，更换上新鲜Keratinocyte-SFM后，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中继续培养24 h。照射同时，温度计检测三种载物界面局部空间(HEKC与灯管之间的空间)温度变化。

1.2.5 改良MTT法测定细胞损伤程度 酶标仪上采用570 nm和630 nm双波长测定吸光度(OD)值。

1.3 统计学方法 统计学分析应用SPSS 11.5软件，进行方差分析及q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

将HEKC培养至指数生长期，分别以泡沫板、锡纸板及冰面为载物界面，进行UVA照射，继续培养24 h后检测OD值，结果见表1；同时监测照射期间载物界面局部空间温度变化，结果见图1。

3 讨论

由表1可以看出，采用不同的载物界面对HEKC进行UVA照射，细胞的损伤程度明显不同，差异具有统计学意义(P<0.01 )。当以冰面作为照射期间的载物界面时，HEKC的损伤程度相对较弱，损伤率仅为19.88%，而以锡纸板为载物界面时，HEKC照射损伤最重，损伤率高达82.76%，细胞损伤程度出现很大的差异。

图1 UVA照射期间不同载物界面局部空间温度变化

分析出现这一差异的原因可能与照射过程中载物界面局部空间温度有关，因此笔者对照射期间载物界面局部空间的环境温度进行了检测。从图1可以看出，锡纸板局部空间的温度随着照射时间的延长升高很快且幅度很大，照射15 min就超过了人体正常体温范围，高达39℃以上；冰面局部的空间温度在照射期间几乎没有变化，远低于人体正常体温范围，维持在一个恒定的低温。分析其原因是，随着照射时间的延长，由于灯管的产热作用照射装置周围的温度会逐渐增加，尤其是载物界面局部空间温度增加更为明显。锡纸板当接受光源照射时具有聚热的作用，短时间内就可使其局部空间温度升到很高，扩大了温度效应对细胞损伤的影响，相同时间UVA照射将会出现细胞损伤过重致大多数细胞都出现了不可逆的损伤，对于研究药物作用效果的现实临床意义不大。然而，以冰面为载物界面时，局部空间维持在恒定的低温，要使该损伤模型达到同等损伤程度就需无限期的延长照射时间，从而增加了细胞在室温环境的暴露时间，不利于细胞生存。同时考虑实际情况下经日光照射皮肤表面温度也会随之升高，温度不可能过低，因此不能完全排除温度效应在照射中的影响。

同时参照本实验室前期研究结果：建立人皮肤细胞紫外线损伤模型的细胞损伤率维持在50%左右时，细胞损伤程度可控、模型稳定及实验的可重复性等均较好。综合分析认为，在建立UVA照射损伤HEKC模型中，充分考虑细胞损伤程度的同时应选择与体内情况较为一致的载物界面。对3种载物界面进行综合比较的结果为：泡沫板作为照射期间的载物界面具有一定的优势，照射后细胞损伤程度适中(损伤率为55.58%)，照射过程中局部空间温度维持在37℃左右，与体内环境相似，利于药物疗效的研究，其现实意义不容忽视。因此，选其作为UVA损伤HEKC模型建立过程中的载物界面较为理想。

参 考 文 献

[1] 倪建华.长波紫外线对人皮肤成纤维细胞生长的影响.上海预防医学杂志，2004，16(8)：365-367.

[2] 王红伟，尚兰琴，郝卫东.长波紫外线致人皮肤成纤维细胞凋亡和活性氧生成的作用.北京大学学报(医学版)，2003，35(1)：69-73.

[3] 陈勇，戴和平，龙志高，等.人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养.湖南医科大学学报，2003，28 (5)：481-484.

[4] 孙曙光，程大胜，王良喜，等.表皮细胞培养条件的优化.山东医药，2006，46(5)：13-14.

[5] QIN Fen-Ju，ZAN Lin-Sen.Culture conditions for the isolation and growth of scalper epidermal cells in Vitro.Chinese Journal of Zoology，2003，38(6)：76-79.