眼刺激性体外评价方法研究进展

刘天强　肖　丹

摘要：在中药滴眼液的研发中，寻找一种简单、快速的刺激性评价方法体系非常必要。兔眼刺激试验(TheDraize test)作为眼部安全评价标准已逾几十载，缺点较多：评分系统主观性强、动物外推至人种属差异大、实验室间变异性大等。许多实验室在近20年间相继提出了新的体外试验方法，对体外眼刺激性试验方法进行了综述。关键词：Draize眼刺激试验；刺激性；体外试验；综述

中图分类号：R246.82文献标识码：A文章编号：1673-2197(2009)05-0130-03

毒理学一直致力于保证人类免受各种物质的伤害，如药品、化工产品、化妆品及家庭用品等。最易导致偶然接触伤害的部位一般是眼睛和皮肤。这种由化合物刺激导致的生理反应一般称为刺激性，包括客观的生理变化(局部红肿、水肿)和主观感受(瘙痒、疼痛)。在生产、使用这些物品时，都需要对其刺激性进行评价。时至今日，最可靠的安全性评价方法还依赖于动物试验。但是当今社会，动物福利日益受到重视，兔眼刺激性试验在伦理、科学上均受到质疑，因此寻找节约高效的试验方法推动了眼刺激性试验评价方法的进展。

1Draize兔眼刺激性试验简介

随着制药工业的发展，特别是一些对眼睛有副作用的药物的发现，在20世纪初形成了眼毒理学。其主要研究目标之一是建立一种能用于评价新物质潜在刺激性的方法。

Jonas Friedenwald(1897-1955)提出了采用对眼睛各部位毒性分别进行等级评分的方法评价刺激性的方法体系。在Friedenwald的基础上，John H.Draize(1900-1992)和他的同事在1944年提出了一种新的评价方法，该方法采用皮肤和兔眼作为试验对象，描述了如何进行剧烈的、温和的和长期刺激性的评价。这些方法相继被其它实验室用以筛选化合物刺激性，被称为“Draize试验”。此后，Draize的技术标准被FDA采用并用以评价某些物质的安全性，在相当长的一段时间里被FDA视为当时最有价值和最可靠的方法，有金标准(Golden standard)之称。由于该方法每个步骤都要认真审查和观察，其重复性、关联性、经费及伦理等诸多方面均遭到了科学界的质疑与批评，20世纪60年代，这种试验方法更是遭到广泛的批评。

实验数据变化较大导致试验重复性较差，特别是轻微刺激性更为明显。Draize test结果重复性较差主要源于两个方面。其一，受试动物兔的种属个体差异难以控制；其二，试验员在对兔眼的观察和评分上存在的诸多差异难以控制。虽然可以通过扩大样本容量和培训试验员来减少这些误差，但是重复性较差的缺点还是难以克服。

相同种属的动物可以以各种不同的方式对刺激性物质进行应急，不同的试验者在相同的试验中可能得到不同的数据。加之兔眼的解剖学结构、生物化学和人眼也不尽相同，如：兔眼眼泪产量相对较少，眨眼频率与人眼不同，眼表面的敏感性较人眼差。Draize test只是从炎症和毒性两个方面的表现对刺激性进行评价，难以全面反映刺激性作用。其外部的观察只能将结果限制在某几种特定的变化中，不能够探知其内在的机制。当受试物质直接接触外眼时，不仅能造成毒性损伤与炎症反应，还能带来烦躁、迟发型变态反应、结构变化、各种分子的改变以及全身效应。而这种眼部刺激性试验却难以全面体现这些变化。这种人眼与兔眼的关联性遭到质疑也就在所难免。

很多科学家对Draize test主要根据两种思路进行修订，一种是用尽量少的动物挖掘尽量多的信息，同时保证其与人眼反应的较好相关性。另外一种是避免直接将化合物作用于眼，而是先进行皮肤刺激性试验。科学家在Draize test的基础上研究形成了一种新的可被用作替代Draize test的体内研究方法，称作低容量眼部试验法(10wvolume eyetest：LVET)，该方法相比Draizetest与人眼具有更好的相关性，优于Draize试验，被证明是一种可以接受的替代方法。但LVET与Drame test都过高估计了人眼对刺激物的反应。

2Draize eye test体外试验方法概述

为了将试验给动物带来的痛苦降到最低程度，人道主义者提出了3R(Replacement，Reduction，Refinement)的理念，提出了多种多样的体外试验方法，这些方法运用的技术越来越先进，检测的范围与部位也越来越丰富，现将这些常用的体外试验方法及其优缺点简述如下。

2.1红细胞溶血试验(Red Blood Cells Test)

用多因素分析方法发现Draize test的检测原理大部分可以用蛋白变性和细胞膜破坏来解释。由此发展了基于测定从红细胞中漏出的血红蛋白的量来评价膜损伤的试验方法——溶血试验(Hemolysis test)。RBCs试验用来评价某些受试物引起的细胞初始反应(例如接触化合物后的角膜浑浊度改变)，这些受试物主要损伤细胞胞浆膜以及使某些蛋白质变性；而非刺激性物质则不会造成这样的反应。该方法的假说认为这种反应与眼部组织的刺激反应所产生的初始事件具有一定的相关性。该方法通过分光光度法测定化学物作用后的红细胞悬液吸光度，计算出溶血率和HC50值(即使50％红细胞溶血的受试物的浓度值)用作评价受试物的刺激性指标。

RBCs试验是一种作用机制明确、不需用特殊的仪器和设备、操作快速简便、不需无菌处理、费用低廉等优点。但该法检测终端过于单一，难以替代Draize test用于全面评价受试物的刺激性，只能用于粗筛试验。

2.2血红蛋白变性试验(Haemoglobin Denaturation Test)

血红蛋白变性试验(Haemoglobin Denaturation test，HD test)是用评价蛋白变性的指标RDC50(血红蛋白变性率为50％的受试物浓度)和1％λmax(1％受试物的最大可吸收波长变化值)来预测化学物质的眼刺激性的一种试验方法。这种方法的理论基础是眼刺激性反应是由一系列的蛋白质变性所引起的，而血红蛋白变性时会引起吸光度特性的改变，利用血红蛋白变性试验来检测表面活性剂对血红蛋白结构活性的量化改变作为评价刺激性的指标。最初的方法是通过吸光度值计算血红蛋白的变性率而建立的。后来发明者提出了新的方程式用以与Draize分值进行相关性研究，比如进行log数值代换等。Hayashi T等发现蛋白质变性试验(HD test)与红细胞溶血试验(RBCs test)联合试验结果与Draize评分的相关性非常高。在刺激性评价中，应适当考虑二者结合进行。该法不需要特别设备，操作简单，试验流程短，可大大缩短粗筛的时间。但血红蛋白变性试验不能用于在418 nm有强吸收峰的有色物质和超过磷酸盐缓冲液范围的强酸，也不能检测磷酸

盐变性以外的因素引起的眼刺激性。

2.3基于鸡胚尿囊绒膜试验(Chorioallantoic Membrane-based Assays)

受精鸡卵尿囊绒膜试验(Hen's egg test-ehorioallantoic-membrane，HET-CAM)利用尿囊绒膜(CAM)与结膜结构相似的特点，通过以下两种方法检测化学物对CAM的损伤来评价其眼刺激性。显微镜观察法(HET-CAM score)是用解剖显微镜观察经化学物作用后不同时间段CAM血管的损伤情况，以出现溶血(hemolysis)、出血(haemorrhage)和凝血(coagulation)作为指标进行评分。台盼蓝染色法(CAM-TB)是通过分光光度计测定经化学物处理后CAM吸收的台盼蓝量来评价CAM的损伤。

用CAM方法评估特定种类化学品眼刺激性的试验都显示较满意结果。CAM试验能很好预测角膜混浊和虹膜炎症；比较而言，HET-CAM分析表面活性剂类产品的效果较好，CAMVA分析醇类效果较好。运用该种方法每天可以检测大量受试物，且不需要特殊仪器，有快速、灵敏、简单和价廉的优点。由于使用的是孵育第10天的鸡卵，CAM上没有神经支配，避免了对鸡胚造成的痛苦并可减少动物的使用量，符合“3R”精神。

2.4离体器官试验(The Enueleated Eye Test)

离体眼球试验(The Enucleated Eye Test简称EET)是一种非常有价值的眼刺激性评价方法。该方法使用离体眼球，其试验系统非常接近体内试验，无需活体动物。该试验通过检测角膜水肿、混浊及荧光素滞留，并进行组织学观察评估受试物的眼刺激性。在这些测定指标中，角膜水肿客观性和区分不同刺激性物质的敏感度都较高，再辅以浑浊度和荧光素滞留量两指标，形成了一种具有相当说服力的评价眼刺激性的试验方法。包括离体兔眼、猪眼、鸡眼等试验模型，现在主要作为一种评价各种产品及其成分、个体化合物等是否对眼部具有腐蚀性和严重刺激性的筛选方法。该法也可作为体外联合评价试验的筛选方法之一。

2.5细胞试验(Cell Cultrue)

细胞毒性试验通过检测培养细胞对染料或其代谢产物的摄取、还原、排斥、释放及炎性介质漏出等变化，反映受试物对细胞结构及存活力的影响。采用该研究思路，国外建立了多种细胞模型，采用检测多种指标评价物质潜在的刺激性，检测的指标主要包括细胞增殖、膜完整性和细胞活性。兔眼角膜上皮细胞就是较早用于该领域的细胞模型，主要通过LDH和MTT两种方法进行检测评价。O.Doucet等利用人眼角膜细胞建立三维上皮模型，以细胞毒性反应为终点，结果发现检测结果与动物试验结果具有良好的相关性。检测终点也发展到对一些微观指标的测定，如细胞因子含量等，例如Debbasch等发现以IL-8释放为终点的人类角膜上皮细胞毒性试验是一种敏感而可靠的预测人类轻微眼刺激性产品的方法。

2.6商业试剂盒

采用兔角膜上皮细胞毒性试验作为评价方法而建立的CornePack试剂盒，具有灵敏度高、可应用于有色物质的估测等优点，但是与其它细胞毒性方法相比，对不溶物质检测，其重现性不好，而且与体内试验的相关性较差。Gor-don和Bergman采用分光光度计测定合成蛋白质基质中的浑浊度来估测受试物对眼的刺激性，建立了EYTEX试验系统。将人的鳞状上皮细胞和基质纤维细胞共同培养在尼龙表面，形成有气液表面的上皮层原型而建立的SKIN2^TMZK1200试剂盒，其结构类似于眼角膜和结膜。Kurishita等用此模型验证了39种化妆品成分的刺激性，发现相关性较好(r＝0.71)。

2.7其它

Adriaens.E等使用蛞蝓黏膜刺激性试验(SlugMucosal Irritation assay SMI)作为筛选眼刺激性的试验方法，该法通过检测蛞蝓粘膜表面暴露于受试物以后的蛋白质变化和酶的释放评价刺激性，可以检测出热和烧灼感的影响，这是其它体外方法无法实现的。研究表明，该试验是一种有希望的筛选眼刺激性物质的评价方法，但耗时较长，不适合大批量的筛选试验。

3结论与展望

现阶段提出的一些体外试验方法虽然在一定程度上能够反应出其对眼部的刺激性，但是每种方法都有其各自的缺点，没有一种方法能像Draize test一样具有多功能、多指标的试验结果，所以几乎没有一种方法能够被官方所认可接受用以替代Draize test。

当今国际上流行的化学物眼刺激检测策略有两种：多层试验(TIERED TEST)和同步联合试验(BATTERY TEST)。多层试验又称逐步检测策略，即通过文献资料、理化性质等对化学物的刺激性预先估测，然后进行体外试验即替代试验，对不能确定刺激效应的物质才进行少量动物的确定性试验。同步联合试验根据刺激作用发生的机制，采用多种体外试验相结合的方式进行联合检测，比如用细胞毒性试验、蛋白质变性试验、溶血试验和三维结构细胞毒性试验等几个试验相结合，共同预测化合物的眼刺激性。但在对体外方法进行同步联合试验的过程中，需要发展合适的统计学方法或建立有效的预测模型。

目前我国在这方面的研究刚刚开始，与国外差距较大，国内已经有学者开始尝试进行了这方面的实验研究，但是这种研究的深度与广度还远远不足，我国学者在这一研究领域的发展空间十分广阔。将这一领域的研究成果运用于中药滴眼液的研发必将加快这一产业的快速发展。

责任编辑曾楚华