辣椒疫霉菌对不同辣椒品种抗病性相关酶活性的影响

孙文秀 朱小慧

（长江大学生命科学学院，湖北荆州，434025）

辣椒疫霉菌对不同辣椒品种抗病性相关酶活性的影响

孙文秀 朱小慧

（长江大学生命科学学院，湖北荆州，434025）

对优质抗辣椒疫病品种海丰Zt-277、特大汤椒二号F1和感辣椒疫病品种天骄2号进行辣椒疫霉菌接种，测定了辣椒叶片中与抗病性相关的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活性和丙二醛（MDA）的含量变化，结果表明，接种与未接种相比，抗病品种叶片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品种，MDA的含量提高幅度要高于感病品种。但不论辣椒疫霉菌接种与否，抗病品种辣椒叶片中SOD、POD活性高于感病品种；感病品种辣椒叶片中MDA含量高于抗病品种。

辣椒 抗病性 超氧化物歧化酶 过氧化物酶 丙二醛

辣椒疫病（Phytophthora capsiciLeon.）是一种世界性土传病害，严重影响我国及世界各国的辣椒生产，造成巨大的经济损失。辣椒疫霉菌是一种土传性寄生菌，存活时间长，寄主范围广，致病变异强，菌株间存在明显的致病分化现象，给有效地防治辣椒疫病带来很大的困难。

植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥着重要作用，这主要包括酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白（PR蛋白）家族[1]。如过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（SOD）等是存在于植物体内与抵抗病原微生物侵染有关的酶[2]。为从生理生化方面阐明植物的抗性机理，近年来，人们越来越重视研究植物的抗病性与活性氧及细胞内保护酶系统的关系，先后发现黄瓜、水稻、小麦、玉米、茭白等多种植物受到病原菌感染后，其体内活性氧代谢及防御酶系的活性发生变化，并与植物的抗病性相关[3～7]。但国内外学者就某些植物的抗病性与活性氧及其代谢酶的关系的研究中，试验结果不尽一致。

近年来，国内外学者对辣椒疫霉菌的分类、形态特征和发病症状有较为详细的研究。本试验对不同抗性辣椒品种接种疫霉菌后叶片中抗病性相关酶的活性进行测定，并分析其与抗病性的关系，以期为辣椒苗期抗疫病性早期鉴定和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒品种为经抗病性鉴定的海丰Zt-277（高抗）（编号为1号）、特大汤椒二号F1（抗病）（编号为2号）和天骄2号（感病）（编号为3号）。

供试菌种选用分离自湖北荆州辣椒田的致病力较强的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici），编号为JZ-01。

试验所用试剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、磷酸缓冲液、甲硫氨酸、EDTA-Na2、核黄素、酶液、愈创木酚、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸。

1.2 试验方法

①辣椒疫霉菌接种 将供试辣椒疫霉菌JZ-01首先从试管中转移至燕麦琼脂培养基（OMA）平板上，培养7 d后用Petri溶液培养3 d，于4℃冰箱中放置30 min诱发产生大量孢子囊并释放游动孢子，配制一定浓度的游动孢子悬浮液作为接种体。辣椒种子用1%的次氯酸钠液表面消毒1 min，自来水反复冲洗后，置28℃温箱中黑暗保湿催芽，露白后，播入装有灭菌土（120℃，2 h）的花盆中，生长至5～6叶期用已配好的游动孢子悬浮液进行接种。

②酶活性的测定 辣椒疫霉菌接种后5 d取样，剪取接种植株倒3叶叶片，去除叶脉后剪碎，取0.5 g置于预冷的研钵中，加1.0 mL预冷的磷酸缓冲液（pH值7.8）和少许聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 mL，于4℃，13 000 r/min下离心20 min，上清液即为酶液粗提液。以未接种植株倒3叶叶片为对照。试验重复3次，取平均值。

表1 辣椒疫霉菌接种对不同辣椒品种SOD，POD活性和MDA含量的影响

a.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 参照陈志谊等[8]方法并稍作修改。在3 mL反应体系中，加入0.05 mol/L磷酸缓冲液 1.5 mL，130 mmol/L甲硫氨酸 0.3 mL，750 μmol/L NBT 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黄素0.3 mL，蒸馏水0.25 mL，酶液0.05 mL。以不加酶液为对照，混匀后于4 000 lx日光下反应20 min（要求各管受光情况一致，温度高时时间缩短，温度低时时间延长）。以抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原的50%为一个酶活性单位，按下式计算SOD的活性：SOD总活性＝(ACK－AE)×V/(ACK×0.5× W×Vt)。

式中，ACK为对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积 （mL）；Vt为测定时样品用量（mL）；W为叶样品鲜质量（g）。SOD单位为U/g。

b.过氧化物酶（POD）活性的测定 POD活性测定参照李靖等[9]方法并加以改进。

c.丙二醛（MDA）含量测定 参照赵世杰等[10]方法测定MDA含量。取上清液分别在450 nm，532 nm和600 nm处测定吸光度值OD450、OD532和OD600。按公式：C＝6.45（OD532－OD600）－0.56OD450求出样品的MDA浓度，MDA含量＝MDA浓度×提取液体积／植物组织鲜质量，MDA单位为μmol/g。

2 结果与分析

2.1 辣椒疫霉菌接种对辣椒叶片SOD活性的影响

不同抗性辣椒品种接种辣椒疫霉菌后SOD活性有明显差异（表1）。未接种辣椒疫霉菌时，对辣椒疫病抗性越强的辣椒叶片中SOD活性越高，海丰Zt－277叶片中SOD活性达402.38 U/g，而感病辣椒品种叶片中SOD活性为327.15 U/g。辣椒疫霉菌接种5 d后，供试辣椒叶片中SOD的活性均有所提高，但提高的幅度因抗性的强弱而不同：海丰Zt－277提高幅度最小，仅有5.02%；特大汤椒二号F1叶片中SOD活性提高幅度较大；而感病品种天骄2号叶片中SOD活性提高率为21.52%。由此可以看出，SOD含量的高低与辣椒抗病性强弱有一定的关系。

2.2 辣椒疫霉菌接种对辣椒叶片POD活性的影响

由表1可知，不论接种辣椒疫霉菌与否，供试不同抗性的辣椒叶片中POD活性均较低，但接种辣椒疫霉菌5 d后，POD活性增幅较大。接种后高抗和抗病品种叶片中POD活性比接种前分别提高24.97%和23.66%；而感病品种天骄2号叶片中POD活性提高53.83%，上升剧烈。由此可以看出，接种辣椒疫霉菌后不同抗性的辣椒叶片中POD活性均有所升高，且感病品种POD活性提高幅度明显高于高抗和抗病品种。

2.3 辣椒疫霉菌接种对辣椒叶片丙二醛（MDA）含量的影响

由表1可以看出，在无辣椒疫霉菌胁迫时，辣椒叶片中MDA含量普遍较低，且抗辣椒疫病的辣椒品种叶片中MDA含量比感辣椒疫病品种低，接种辣椒疫霉菌后植株体内的MDA含量均高于未接种植株，且不同品种间MDA含量变化较大。高抗材料海丰Zt－277叶片中MDA含量大幅提高，达60%以上；而感病材料天骄2号叶片中MDA含量提高幅度明显低于抗病品种，但抗病品种中MDA含量仍低于感病品种。

3 小结与讨论

研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，其细胞内自由基产生和清除的平衡会受到破坏，使一系列活性氧积累，伤害植物细胞膜系统，造成色素损失、膜透性扩大、离子外渗，甚至导致植株死亡等。植物体内广泛存在能清除活性氧代谢的保护酶，其中SOD，POD和CAT是细胞抵御活性氧伤害的主要酶类，可以保护膜系统免受自由基的伤害，这3种酶与植物抗病性有重要关系。MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，它的积累是活性氧毒害作用的表现，可作为膜脂过氧化作用的一种指标。

本试验中，不论接种辣椒疫霉菌与否，抗病品种辣椒叶片中SOD，POD活性高于感病品种，但接种疫霉菌后，抗病品种叶片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品种，这与马海宾等[11]的研究结果基本一致。本研究表明感病品种辣椒叶片中MDA含量在接种辣椒疫霉菌前后均高于抗病品种，但抗病品种辣椒叶片中MDA含量提高幅度要高于感病品种。这表明海丰Zt－277抗病品种具有清除自由基和抗膜脂过氧化的作用，与该品种接种后辣椒疫病发病轻、抗性好是一致的。

植物中与抗病性相关的酶有多种，它们是相互协同而不是单独起作用的[12]，不同植物甚至同种植物的不同种、不同胁迫因子等条件下酶活性的变化与抗病性也不相同，甚至相反。如在水稻白叶枯病的研究中，吴岳轩等[13]、曾富华等[14]、廖朝晖等[15]、肖用森等[16]发现水稻感染白叶枯病菌后叶片中 SOD，POD活性和MDA含量变化结果不一致。上述试验结果一方面可解释不同植物病害系统，其抗病反应过程有差异，且不可能所有的病害系统都与POD和SOD等有相同的变化关系，即使有关也可能存在程度和方法上的差异。另一方面也说明，确定某种作物抗或感某种病害除对抗性相关酶活性和个别物质含量的变化进行研究外，还需要对其他抗性相关系统作进一步探讨。

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[5]王雅平，吴兆苏，刘伊强．小麦抗赤霉病的生化研究及其机制的探讨[J]．作物学报，1994，20（3）：327-333.

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[13]吴岳轩，曾富华，王荣臣．杂交稻对白叶枯病的诱导抗性与细胞内防御酶系统关系的初步研究[J]．植物病理学报，1996，26（2）：127-131.

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[15]廖朝晖，朱必凤，刘安玲．水稻对白叶枯病菌抗性与活性氧关系的研究[J]．中山大学学报：自然科学版，2002，41（4）：78-81.

[16]肖用森，王正直，郭绍川．白叶枯病菌对杂交稻幼苗叶片中活性氧清除剂的影响[J]．作物学报，1998（24）：118-122.

Effects of Phytophthora capsicion Activities of Enzymes Related to Disease-resistance in Pepper

SUN Wenxiu,ZHU Xiaohui
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025)

Two resistant cultivars,Haifeng Zt-277(high resistant to Phy to phthorablight),Tangjiao No.2(resistant to Phy to phthorablight),and a susceptible cultivar Tianjiao No.2 (susceptible to Phy to phthorablight)were used as materials for Phytophthora capsiciinoculation.The activities of enzymes related to disease-resistance including superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD)and the content of malondialdehyde (MDA)in pepper leaves were tested after the inoculation. The results indicated that the activities of SOD and POD in resistant pepper leaves were significantly higher than those of susceptible pepper whether or not inoculated withP.capsici.However,the MDA content in the susceptible pepper was higher than that of resistant peppers.

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.024

本研究受长江大学博士创新基金（2006A00433）资助

孙文秀（1979-），女，博士，讲师，主要研究方向为植物病理学。电话：13797396503

2009-02-18

Ker words:Pepper;Disease-resistance;Superoxide dismutase;Peroxidase;Malondialdehyde