水产品中氯霉素残留检测技术的研究进展

高 林 陆 怡 史贤明

摘要:介绍了水产品中氯霉素残留检测分析方法的研究进展,并阐述了各检测方法的特点及检出限,以期为水产品氯霉素残留检测提供参考。

关键词:氯霉素;检测;水产品

中图分类号:O69文献标识码:A文章编号: 1007-5739(2009)20-0340-02

氯霉素(chloramphenicol,CAP)于1947年从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuela)的培养滤液中分离出的结晶性抗菌素,是第一个采用化学合成法生产的抗生素,它是一种有效的广谱抗生素,对多种病原菌有较强的抑制作用。在水产养殖业中,也常用氯霉素治疗各种传染性疾病。但研究表明,氯霉素存在严重的毒副作用,能抑制人体骨髓造血功能,引起人类的再生障碍性贫血,粒状白细胞缺乏症,新生儿、早产儿灰色综合症等疾病,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性,因此氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视,欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零允许量”。我国是一个水产养殖大国,养殖规模不断扩大,但养殖过程中滥用抗生素,已成为一个严重的水产品安全问题[1]。

氯霉素残留检测方法的建立始于20世纪70年代,随着新技术的不断出现,氯霉素的检测方法有很多种,大致可分为3类,即微生物法、化学分析法、免疫学检测法。

1微生物法

微生物检测氯霉素法可大体分为2种:一种是基于抗生素对微生物生长的抑制作用,主要有棉签法、杯碟法、纸片法、TTC法、戴尔沃检测、BY法等;另一种是由于微生物对氯霉素敏感而引起生化特性的变化,如氯霉素对鳆发光杆菌的抑光作用,通过检测发光强度的变化来检测氯霉素的含量。

(1)棉签法。棉签法是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。该方法是用棉签(拭子)采取动物体内的组织液,然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。根据棉签周围的抑菌圈有无以及大小来判断抗生素残留。梅先之等(1997)曾用该法检测鲤鱼中的CAP残留含量,该方法的检测限是1mg/kg,但容易造成漏检。

(2)杯碟法。样品经处理后,注入牛津杯中,与含菌液的鉴定平板贴合,培养后,根据抑菌圈有无及大小判定结果。采用不同的试验菌种,可检测不同的抗生素[2]。该方法灵敏度比棉签法高,能排除一定的干扰,但要进一步提高灵敏度很困难。

(3)TTC法。在样品中加入嗜热链球菌经培育2.5～3.0h后,加入4% TTC指示剂(三苯基四氮唑)水浴培养30min,颜色不发生变化为阳性;如果样品呈红色则为阴性。该法费用低,操作简单;缺点易出现假阳性。

(4)戴尔沃检测法。原理是利用微生物-嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5～3.0h后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素,嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色。该法具有操作方便、容易判断、结果可靠、费用适中等优点;但也易出现假阳性。

(5)发光细菌法。王亚群等[3]建立了一种发光细菌检测氯霉素残留的新方法。在鳆发光杆菌培养液中添加不同浓度的氯霉素溶液,通过控制菌体起始发光强度,菌液与氯霉素作用时间,菌液与氯霉素体积比等建立发光细菌检测水产品中氯霉素体系。该体系对氯霉素的检测灵敏度可以达到0.1ng/mL,该法成本较低、操作快速简单、检测限低。作为水产品中痕量氯霉素残留的一种快速、灵敏的检测方法。

2免疫分析法

免疫分析法是以抗原与抗体特异性、可逆性结合反应为基础的一类常用分析方法。由于氯霉素是半抗原,不能刺激机体产生抗体,将氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯结构和大分子蛋白结合后均可作为完全抗原有效制备相应的抗体,在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量,常用的有酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、固体免疫传感器、化学发光酶免疫法(CLEIA)等。

(1)酶联免疫法(ELISA)。ELISA法简单、快速、灵敏度高、重复性较好,适用于大规模CAP的残留筛选检测,目前市场上有多种氯霉素检测试剂盒供应。陈雪昌等[2]报道了采用德国R-Biopharm 公司生产的RIDASCREEN 氯霉素试剂盒检测虾肉中的氯霉素残留方法,该法平均检测下限为0.012 5μg/kg,回收率为88.1%～94.4%,RSD为2.98%～6.67%。美国IDS公司2009年3月新上市了一步法快速氯霉素ELISA试剂盒,是目前市面上操作时间最短的产品,检测时间为20 min。但是ELISA的缺点在于影响因素较多,易出现大量假阳性结果。

(2)化学发光酶免疫法(CLEIA)。CLEIA法是一种采用化学发光剂做为酶反应底物的酶标记免疫测定的方法。胥传来等[4]建立了化学发光酶免疫检测方法(CLEIA)检测对虾组织中CAP的残留,检测灵敏度可达到0.01μg/L。高彬文(2007)利用化学发光酶联免疫法检测鱼虾中氯霉素残留,检测限为5.8×10-4 μg/kg。该法灵敏度高、分析速度快、仪器简单、不需复杂的样品前处理过程等优点,但ECLIA法对实验条件的要求较高,其稳定性及敏感性尚待进一步提高。

(3)免疫胶体金法。免疫胶体金技术是20世纪80年代发展起来的一种新型免疫标记技术,应用该技术制成的胶体金试纸条具有简便、快速、灵敏、特异性高等优点,但其稳定性及灵敏度尚待进一步提高,且不宜定量。李余动(2005)建立了胶体金免疫层析试纸条法快速检测虾肉等组织试样的氯霉素残留,灵敏度最低值可达到1ng/mL,只需5～10min。

(4)放射免疫法(RIA)。Arnold和Somogyl[5]建立了放射免疫分析检测方法,该方法灵敏度高,最低检测限为200 ng/kg,但该法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需要复杂仪器设备等缺点,应用范围受到限制。

(5) CHARM Ⅱ。CHARM Ⅱ检测氯霉素残留试剂盒为美国FDA推荐使用的检测仪器,由美CHARM Science公司研制生产的第2代产品。该法灵敏度高,对于鱼组织中氯霉素残留量的检出限可达0.15μg/kg,但同样存在假阳性结果的问题

(6)伏安免疫法。宋巍巍[6]建立了以间接竞争ELISA为基础、ALP为标记酶、pNPP底物、伏安法为检测法的伏安免疫分析体系,该方法检测CAP的检出限为0.064μg/L,检测线性范围为0.15～600μg/L,与传统的ELISA法相比,此法灵敏度高,特异性强,操作简单。

3色谱技术

色谱方法可检出样品中的痕量污染物,具有检测限低、精确度高等特点,是水产品中CAP残留检测最有效的一类方法,但缺点是操作复杂、时间长、成本较高。

(1)高效液相色谱法(HPLC)。HPLC法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法,此法不需衍生化步骤、样品处理程序较为简单、重复性好、假阳性少,但检出限较高,为5～10μg/kg,回收率偏低,处理过程复杂、分析速度慢等缺点。Keuken等(1986)报道了用高效液相色谱法筛选和确证在可食用的动物组织中的氯霉素残留,检出限为5μg/kg[7]。

(2)气相色谱法(GC)。利用GC检测氯霉素的优点是高分离效能、检出限低、灵敏度高,但需要衍生化,过程繁琐,易出现假阳性。吴明亮[8]报道了苏北出口水产品中氯霉素残留测定的气相色谱法。该方法测定值可达0.1μg/kg以下,该法重复性好,假阳性少。

(3)联用技术。联用技术可扬长避短,一般兼分离、定量和定性(分子结构信息)于一体,因而特别适用确证性分析。常见的联用技术有TLC-MS、LC-MS、GC-MS、SFC-MS、CZE-MS、LC-NMR等。LC-MS是美国FDA推荐使用的氯霉素确证方法,其灵敏度较荧光检测器高1个数量级,能方便地对ng/kg级的残留组分进行检测与结构确证。林海丹(2005)报道了水产品中氯霉素药物残留的LC-MS/MS分析方法,该法测定检出限为0.1μg/kg,回收率为95%～110%。黄冬梅(2006)报道了利用气质联用技术分析水产品中氯霉素的残留量,当添加水平为0.5～10.0μg/kg时,回收率为74.8～84.8%,相对标准偏差为 4.90～8.99%。

4其他分析方法

目前还有很多其他分析方法运用在氯霉素残留的检测上。SFC可弥补GC和HPLC的不足,可以方便连接,但不可能替代GC和HPLC,SFC最大的优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器。

毛细管区域电泳(CZE)兼有高压电泳的高速、高分辨率和HPLC灵活、高效的优点,可简化样品前处理、多残留分析自动化,CZE的主要问题是样品量太少,限制了检测的灵敏度。伏安法相对误差较小,速度快,但汞易挥发且有毒,灵敏度低。氯霉素乙酰转移酶(CAT)突变体检测氯霉素,该法的优点为成本低,操作简便、快捷[9]。分子印迹技术的发展为CAP的前处理提供了新的技术。但目前还处于初步研究阶段,有待更进一步的研究。

总体说来,基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高,特异性强,试样预处理简单,分析时间短,现在已出现一些试剂盒产品,使用方便,因此,有广阔的应用前景。色谱方法可检出样品中的痕量污染物,具有检测限低、精确度高等特点,但是存在着操作复杂、时间长、成本较高的问题,尤其不适宜作为水产品生产流通过程中的现场监测,也无法对污染物质进行生物危害性评估。同时一些新的生物学方法也不断得以研究开发,如发光细菌检测氯霉素、氯霉素乙酰转移酶突变体检测等由于具有操作简便、灵敏度高等优点也逐渐得到运用。

5参考文献

[1] 胡顶飞,沈建忠. 氯霉素类抗生素的残留分析[J]. 中国兽药杂志,2001, 35(5):55-57.

[2] 陈雪昌,刘琴,钟志,等. 酶联免疫法检测虾肉中氯霉素[J].浙江海洋学院学报(自然科学版),2005,24(1):73-76.

[3] 王亚群,王静雪,林洪,等. 发光细菌法检测水产品中氯霉素体系的建立[J]. 中国海洋大学学报,2009,39(1):66-70.

[4] 胥传来,彭池方,郝凯. 化学发光酶免疫法测定水产品中残留氯霉素[J].分析化学,2005,33(12):1809.

[5] ARNOLD D,SOMOGYI A. Trace analysis of chloramphenicol residues in eggs,milk,and meat comparison of gas-chromatography and radioimmunoassa[J].Journal of the association of official analytical chemists,1985,68(5):984-990.

[6] 宋巍巍,丁明星,张挪威,等. 伏安免疫法检测牛奶中氯霉素残留[J].分析化学,2007,35(12):1731-1735.

[7] KEUKENS BEEK. High performance liquid chromatographic screening and con firmation methods for chloramphenicol residues in meat with off-line cartridge s ample clean-up and on-linediode array UV-VIS detection of Chromatogr,1986(352):445-453.

[8] 吴明亮.水产品中氯霉素残留量的检测报告[J].农产品加工·学刊,2007(6):88-90.

[9] 王艺颖. 氯霉素乙酰转移酶突变体检测氯霉素[D].上海:华东师范大学,2005.