线粒体ＡＴＰ敏感性钾通道、一氧化氮合酶在四氢生物蝶呤保护再灌注心肌中的作用

钟　标　钟焕清　陈海生

【摘要】目的 研究线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道（mitoKATP）、一氧化氮合酶(NOS)在四氢生物蝶呤（BH4）减轻心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中的作用。 方法将64只成年大白兔随机分成4组，建立Langendorff模型灌注其离体心脏，加入不同成分的K-H液灌流、停跳、复灌，观察冠脉流量（CF），测定冠脉流出液肌酸激酶(CK)的含量以及心室肌NO含量。 结果用含BH4的K-H液灌注的组Ⅱ再灌注后的CF、心肌NO含量增加，冠脉流出液中CK的含量降低。使用含NOS抑制剂L-NAME或mitoKATP抑制剂5-HD预处理，使CF降低，冠脉流出液中CK的含量升高，同时L-NAME预处理后的心肌组织NO含量较其它组下降，各差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论外源性BH4具有抗MIRI的作用，而mitoKATP、NOS参与了这种作用。提高NOS的活性，促进内源性NO的产生，mitoKATP的开放是保护作用的可能机制。

【关键词】四氢生物蝶呤；心肌缺血再灌注损伤； 三磷酸腺苷敏感性钾通道；

一氧化氮合酶

Role of the tetrahydrobiopterin in Myocardial preconditioning: Possible Involvement of Mitochondrial KATP Channels and Nitric Oxide Synthase

ZHONG Biao1, ZHONG Huan-qing2, CHEN Hai-sheng2.

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, Guangdong Province, 516000, China

2.Department of Cardiovascular Surgery, Gaozhou Peoples Hospital, Maoming, Guangdong Province, 525200, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of tetrahydrobiopterin(BH4),5-hydroxydecanoate (5-HD) and Nω- nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on langendorff rabbit heart model. MethodsSixty-four mature rabbits were randomly divided into four groups. The hearts in vitro removed to Langendoff equipment, then perfused with different buffer solution base on the Krebs-Henseleit buffer(KHB) for 30min. Then cardiac arrest was induced for 30min followed by 60min reperfusion. Coronary flow(CF) was recorded. Coronary effluent solution was collected for CK measurion. The dynamic change of myocardial NO content was measured. ResultsBy the treatment with BH4, CF was significantly increased, and CK was decreased than other groups after reperfusion(P<0.05). By the pre-treatment with L-NAME, a specific inhibitor of nitric oxide synthase, or 5-HD, a specific inhibitor of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel(mitoKATP channel), CF was significantly decreased, and CK was increased than other groups after reperfusion. By the pre-treatment with L-NAME, NO levels were decreased than other groups(P<0.05). ConclusionsThese findings suggest that BH4 has a cardioprotective effect against myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in vitro. The protective effect of BH4 appeared to be involved in the opening of mitoKATP channels and the activating NOS then increase the NO production.

【Key words】 Tetrahydrobiopterin; Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury; ATP-Sensitive Potassium Channels; Nitric Oxide Synthase

BH4是所有NOS同功酶的辅助因子，具有稳定NOS结构、稳定NOS活性二聚体、增加L-精氨酸和NOS结合力、促进NO的合成与释放等作用，与内皮功能密切相关[1,2]。外源性补充BH4能保护缺血再灌注心肌[3]，但是具体作用机制仍不清楚。本实验通过观察四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、5-羟基癸酸盐(5-hydroxydecanoate, 5-HD) 和左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)对缺血再灌注心脏冠脉流量（coronary flow, CF）、一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、肌酸激酶（creatine kinase, CK）的影响，研究线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP) 、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)对四氢生物蝶呤减轻心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）作用的影响，探讨四氢生物蝶呤保护缺血再灌注心肌作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康成熟的大白兔64只(广东医学院动物中心提供，体质量2.0~2.5 kg，雄雌各半)，随机数字表法随机分入对照组（组Ⅰ）和BH4组（组Ⅱ）、BH4+ L-NAME组（组Ⅲ）、BH4+5-HD组（组Ⅳ），每组16只。

1.2 主要仪器和试剂

自制Langendorff离体心脏灌注装置，全自动生化分析仪(美国Beckman公司, CX-4 型)，L-NAME、5-HD、BH4购自美国Sigma公司。NO检测试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.3 离体心脏Langendorff灌流模型

实验动物3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，肝素钠(150 IU/kg)抗凝后，迅速开胸取出心脏，立即浸入4℃ K-H液中，排尽残血，连接于Langendorff模型灌注装置上，以37℃ K-H液经主动脉插管逆行灌注30 min，灌注压恒定为70 cm H2O，灌注液持续通入95%O2-5%CO2混合气(流量3 L/min)。停搏前20 min BH4+ L-NAME组（组Ⅲ）、BH4+5-HD组（组Ⅳ）分别用加入L-NAME、5-HD的K-H液进行灌注10min。停搏前10 min BH4组（组Ⅱ）、BH4+ L-NAME组、BH4+5-HD组均用加入BH4的K-H液灌10 min。经30 min灌流后，灌注40 ml 4℃ St. Thomas心脏停搏液进行停搏，时间30 s。心脏停跳期间温度保持在37℃~38℃。心脏缺血30 min后，以37℃ K-H液再灌注60 min。

BH4、5-HD、L-NAME最终浓度为10、100、100 μmol/L。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 在灌注10min、再灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min4个时点收集冠脉流出液记录冠脉流量CF。

1.4.2 全自动生化分析仪分析上述4个时点冠状动脉流出液CK含量。

1.4.3 分别取缺血30 min、再灌注60 min的心室肌，硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量。

1.5 统计学处理

数据以均值±标注差（ ±s）表示，用SPSS 13.0软件进行统计学分析。组间、组内数据比较均用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1与对照组相比，用含BH4的K-H液灌注的组Ⅱ再灌注后的CF、心肌组织NO含量增加(P<0.05)，冠脉流出液中CK含量降低(P<0.05)(表1-表3)。

2.2使用含NOS抑制剂L-NAME（组Ⅲ）或mitoKATP抑制剂5-HD（组Ⅳ）预处理，与组Ⅱ相比，CF降低(P<0.05)，冠脉流出液中CK的含量增加(P<0.05)，同时组Ⅲ的心肌组织NO含量较其它组下降(P<0.05)( 表1-表3)。

3 讨论

内、外源性NO在缺血预适应(ischemia preconditioning, IP)心肌保护中(包括早期、第二期)起重要作用，不仅是触发因子，也是效应因子[4]。机体内产生的NO是由NOS催化非必需氨基酸左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)和O2生成的。BH4是所有NOS同功酶的辅助因子 [1-2]。内源性NO的生成量严格依赖适当的BH4水平[5]。BH4水平的减少可导致NOS功能失调，产生过量的氧自由基而代替NO的产生，进而导致内皮和心肌细胞功能降低[6]。

CK绝大部分存在于心肌细胞胞浆内，心肌细胞以外含量甚微，是一种心肌特异性酶。所以，检测冠脉回流液中CK的含量可以反映心肌酶漏出的程度，间接反映心肌损伤程度[7]。CF的多少则可反映冠状动脉的扩张程度，从而观察冠脉内皮细胞的功能和损伤程度。

mitoKATP被公认为是心肌保护作用中的一个关键环节[8]。mitoKATP的开放不仅参与IP的第一窗保护作用，而且也参与第二窗保护作用，不仅能作为启动因子诱导IP，同时也是IP重要的效应器。它的开放能减轻MIRI [9]。

实验结果提示外源性BH4可提高NOS的活性，促进内源性NO的产生，发挥NO对心肌和冠状血管内皮的保护作用，减少CK的漏出，增加CF。表明BH4能增强冠脉系统的扩张，有利于停搏液在心肌的均匀分布和降温，而在再灌注时则促进有害物质排出，减轻心肌酶的漏出，从而减轻心肌损伤，而这种保护作用也与mitoKATP的开放有关。

参考文献

[1] Fukuda Y, Teragawa H, Matsuda K, et al. Tetrahydrobiopterin restores endothelial function of coronary arteries in patients with hypercholesterolaemia. Heart, 2002,87(3):264-269.

[2] Higashi Y, Sasaki S , Nakagawa K, et al. Tetrahydrobiopterin enhances forearm vascular response to acetylcholine in both normotensive and hypertensive individuals. Am J Hypertens, 2002, 15(4):326-332.

[3] Werner ER, Antonius C.F. Gorren, Regine H, et al. Tetrahydrobiopterin and nitric oxide: Mechanistic and pharmacological aspects.Experimental Biology and Medicine, 2003, 228(11): 1291-1302.

[4] Lochnerl A, Marais E, Du Toit E, et al. Nitric Oxide Triggers Classic Ischemic Preconditioning. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2002, 962(5): 402-414.

[5] Katusic ZS. Vascular endothelial dysfunction:does tetrahydrobiopterin play a role? Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 281(3):981-986.

[6] Xia Y, Tsai AL, Berka V, et al. Superoxide generation from endothelial nitric oxide synthase: A Ca2+/calmodulin-dependent and tetrahydrobiopterin regulatory process. J Biol Chem, 1998, 273(40):25804-25808.

[7] Carden DL,Grander DN. Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. J Pathol, 2000, 190(3): 255-266.

[8] Rourke BO. Evidence for mitochondrial K+ channels and their role in cardio- protection. Circ Res, 2004, 94(4): 420-432.

[9] Carreira RS, Facundo HTF,Kowaltowski AJ. Mitochodrial K+ transport and cardiac protection during ischemia/reperfusion. Braz J Med Biol Res, 2005, 38(3): 345-352.