原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤抗炎机制研究

王　峰　郭　健

【摘要】 目的 研究原花青素（GSP）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤抗炎作用机制。方法 大鼠脑缺血再灌注模型完成后，缺血2 h再灌注24 h，其中原花青素大剂量组(40 mg/kg)、小剂量组(10 mg/kg)术前7 d分别腹腔注射2 ml/kg GSP，模型组腹腔注射2 ml/kg生理盐水，1次/d，再灌注前15 min加注1次。观察不同剂量的原花青素对脑组织一氧化氮（NO）含量、髓过氧化物酶（MPO）活性和脑组织神经细胞的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）蛋白的表达的影响。结果 原花青素可显著减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的行为评分；显著降低脑组织中NO含量和MPO的活性，差异有统计学意义（P<0．05）；ICAM-1蛋白的阳性表达率降低，差异有统计学意义（P<0．05）。结论 原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，作用机制之一可能与其抑制炎性反应有关。

【关键词】原花青素；脑缺血再灌注损伤；细胞间粘附分子-1；髓过氧化物酶；一氧化氮

The study of anti-inflammatory mechanisms of procyanidin on cerebral ischemia reperfusion injury of rats

WANG Feng,GUO Jian

【Abstract】 Objective To investigate the Anti-Inflammatory mechanisms of grape seed procyanidin (GSP) on cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI) of rats.Methods The model of MCAO was established by intraluminal suture technique.After 2 h of occlusion and 24 h of reperfusion，The high dose GSP (40 mg/kg) group and low dose GSP (10 mg/kg) group.was injected by intraperitoneal injection for 7 days ，and all groups were given a more time in 15 minutes before operation.The contents of NO and activities of MPO in brain tissue of ischemic hemisphere were measured; the expression of ICAM-1 in the cortex were measured by immunohistochemical method.Results The neurological scores of rats treated with GSP was reduced apparently compared with model group rats (P<0．05); there were apparent reduction of the contents of NO and marked decrease of MPO in GSP group compared with the I/R model group(P<0．05); compared with I/R model group，the expression of ICAM-1 was down-regulated obviously in GSP group (P<0．05).Conclusion GSP could relieve the cerebral ischemia reperfusion injury，one of the mechanisms could be the Anti-Inflammatory effect of procyanidin

【Key words】Procyanidin;CIBI;ICAM-1;NO;MPO

原花青素是一类从葡萄籽中提取出的天然植物多酚化合物，具有极强的抗氧化、清除自由基、抗炎、减轻缺血再灌注损伤^[1]降低血小板凝聚^[2]等保护作用。本试验研究目的旨在探讨GSP在体内对脑缺血再灌注损（CIRI）伤的保护作用及抗炎机制，从而为临床脑保护药物的研制和开发提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 健康Wistar大鼠64只，体质量250~300 g，雄性，由山东鲁抗集团动物中心提供。原花青素：天津尖峰天然产物研究公司（批号：G050804）提供，ICAM-1免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，一氧化氮(NO)试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。德国贺利氏仪器公司PRIM-R台式高速低温离心机；日本OLYMPUS公司BH-2型生物光学显微镜及照相系统；日本Sanyo公司 MDF-330型立式超低温冰箱等。

1．2 模型制备 采用改良Koizumi法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。术前禁食12 h，自由饮水，手术过程中用加热垫和灯泡保持大鼠体温。手术在30 min内完成，缺血2 h后，将栓线抽出再灌注24 h，恢复MCA供血。

1．3 神经功能评分 参考Zea Longa的5分制评分标准。

1．4 标本制备及指标测定 断头取缺血侧的半暗带皮质备用。电子天平称取脑组织块约0．1 g，冰冷生理盐水冲洗残余血液，滤纸拭干，加入Tris缓冲液用玻璃匀浆器制成10%的脑组织匀浆4℃离心3 500转/min，15 min，取上清液进行NO、MPO的测定。取缺血侧半暗带区皮质于固定液中固定，用于免疫组化样本的制作。

1．5 统计学方法 所有数据均用均值±标准差(x±s)表示，应用SPSS 11．5软件进行统计，采用多个样本比较方差分析，P<0．05为显著性检验标准。

2 结果

2．1 GSP对大鼠CIRI后神经功能的影响 GSP大、小剂量组都能改善大鼠神经功能障碍症状，肌力表现增强，其行为评分与模型组相比差异均有统计学意义（P<0．05）。

2．2 GSP对大鼠CIRI后脑组织NO、MPO含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织NO含量MPO活性显著增高，GSP大、小剂量组可显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织血清中NO、MPO含量，与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0．05)，结果见表1。

2．3 GSP对大鼠CIRI后缺血半暗带脑组织ICAM-1表达的影响 与模型组比较，GSP大剂量组ICAM-1表达表达明显降低，可见少量细胞浆内有棕黄色颗粒，阳性表达阳性率显著低于模型组，且大剂量组较小剂量组阳性细胞数降低明显，差异均有统计学意义（P<0．05）。结果见表2、图1、2。

3 讨论

NO通过超氧自由基(O^-₂)发挥细胞毒性作用，生成强氧化剂硝基阴离子(ONOO^-)，后者可导致级联式神经损伤； 髓过氧化物酶(MPO)主要存在于中性粒细胞中，中性粒细胞被激活后，可通过脱颗粒作用释放一种重要的髓过氧化物酶即MPO到胞外或吞噬小体内，催化H₂O₂生成一系列具有广泛生物学效应的活性氧分子从而介导脑缺血再灌注损伤。本实验表明，GSP用药组显著减低大鼠脑组织中MPO活性、NO含量，显示GSP提高脑组织清除氧自由基能力，减轻氧自由基介导的炎性反应对脑组织产生的一系列损伤，从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

在正常情况下脑组织内仅非常少量的ICAM-1表达，但在脑缺血等病理情况下，ICAM-1的表达明显上调，它能够介导白细胞与血管内皮细胞的载附，促使白细胞在缺血区的聚集和浸润，引起血管收缩，降低血流量，加重脑缺血；同时还可释放自由基、蛋白水解酶等细胞毒性物质，导致缺血细胞的进一步损伤^[4-5]。本实验结果表明：与模型组比较，GSP用药组显著减低大鼠脑组织中ICAM-1的表达，且大剂量组较小剂量组作用明显，提示GSP提高脑组织的抗炎性从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

参 考 文 献

［1］ 郭英,蔡秀成,陈秋丽,等.葡萄籽提取物的体外抗脂质过氧化作用.卫生研究，2002，31(1):28-30.

［2］ Chang W C.Sei C K，Soon S,et al.Antioxidant activity and free radicalscavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison． Plant Science，2002，163:1161-1168.

［3］ 王军，于震，贾士奇，等．电针预处理对全脑缺血再灌流大鼠炎性细胞因子的影响．中国实用医药，2008，3(6):4-5.

［4］ Fan PS，Gu ZL，Sheng R，et al.Inhibitory effect of quercetin on proliferation of human microvasular endothelial cells in vitro.Acta PharmacologicaSinica，2003,24(12):1231-1234.

［5］ Lazovic J，Basu A，Lin HW，et al.Neuroinflammation and both cytotoxic and vasogenic edema are reduced in interleukin-1 type 1 receptor-deficient mice conferring neuroprotection.Stroke，2005，36:2226-2231.