人工合成支架材料在组织工程脂肪源干细胞研究中的应用

【文献标识码】B

【文章编号】1673－0364（2009）－06－0346－03

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.015

作者单位：200011上海市　上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科。

组织工程技术有望改变传统的“以创伤修复创伤”的治疗模式，能改变组织缺损治疗中的供体来源不足等缺陷，已成为世界范围内的修复重建外科领域内的研究热点。

种子细胞、支架材料和促进种子细胞在支架上增殖分化的多种因子是组织工程研究的三大基本要素。其中，支架材料在组织构建中起着至关重要的作用。它能够模拟天然细胞外基质环境，在种子细胞形成组织前，引导种子细胞分化、组织再生和控制组织结构，同时还有利于种子细胞获取细胞生长、分化和细胞间相互作用所需的所有细胞因子；而一旦新生组织形成后，通过自身生物降解促进新生组织融入周围的宿主组织中。此外，在体外培养时，它有助于种子细胞从培养基中获得营养，而在移植后又能有效地血管化，通过向支架内生长的血管为种子细胞进一步供应营养。

理想的组织工程支架材料应具备：①良好的生物相容性，不引起宿主的排异反应；②高孔隙度和高表面积的三维立体结构，便于细胞的粘附以及营养和代谢物质的交换；③良好的表面活性，有利于细胞的粘附、铺展、增殖；④生物可降解性，且降解和吸收的速度应该与组织形成的速度相匹配，降解产物不对细胞生长和增殖产生不利的影响。此外，若支架本身能够缓释生长因子等生物大分子则更有利于细胞的生长、增殖、分化以及组织的再生。

1　脂肪源干细胞（Adipose-derived stem cell，ASCs）

近年来，对种子细胞的选择越来越倾向于体外扩增能力强、供区损失小的基质干细胞。2001年，ZuK等 [1]证实，通过吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群。ASCs具有多向分化潜能，且体外扩增能力强、来源充足、获取方便，与骨髓间充质干细胞类似 [2]，目前已广泛应用于脂肪、骨、软骨等多种组织的缺损修复和组织再生的研究。

2　脂肪源干细胞组织工程支架的分类

目前,脂肪源干细胞组织工程支架材料的研究主要涉及天然材料和人工合成材料两大类。天然材料支架（如胶原、壳聚糖等）具有良好的生物相容性、毒性较小、易降解且降解产物易吸收而不产生炎症反应等优点，但也存在机械强度不足、降解速度快以及无法大规模生产等缺点。而人工合成材料的具有良好的物理、力学特性，能通过分子量及分子量分布的改变以调节降解速度，其结构和性能可人为进行修饰和调控，来源充足，加工性能好。人工合成支架材料主要包括高分子材料、生物陶瓷材料和纳米材料等。

2.1　高分子材料

依据大分子主链结构特征的不同，高分子材料可分为聚酯类、聚酸酐类、聚酰胺类、聚原酸酯类、聚氰基丙烯酸酯类等。目前，脂肪源干细胞组织工程研究中应用较多的主要有聚乳酸（Polyactic acid，PLA）、聚乙醇酸（Polyglycolic Acid，PGA）以及二者的共聚物PLGA（Poly-lactide-co-glycolide）等。

PLA和PGA是结构最简单、最典型的可降解线性聚羟基脂肪酸酯，具有极高的生物相容性和生物安全性，其降解产物分别为乳酸和羟基乙酸，均是参与体内三羧酸循环的中间代谢产物，目前已获得美国FDA批准而应用于临床。但是，PGA机械性能较差，受力易变形，会导致种子细胞的损伤，且降解速度快；而PLA疏水性大，与细胞的亲和力较差，且易导致无菌性炎症，其降解产物乳酸所造成的酸性环境在一定程度上影响细胞的成活 [3]。二者的共聚物PLGA兼具了各自的优点，并可以通过调节其分子量、混合比例、结晶性等来获得更稳定、更均匀的降解速度，从而更好地维持了结构的完整性 [4]。

Mehlhorn等 [5]利用PLGA支架（PLA∶PGA=90∶10）来观察脂肪源干细胞向软骨细胞的分化，结果发现，8周后PLGA仍能保持其支架结构，这除了与PLGA本身适宜的降解速度有关以外，还可能与ASCs产生细胞外基质的屏蔽作用和产生可溶性免疫调节因子，如白细胞介素-10和肿瘤坏死因子-a等，抑制体内免疫反应，减缓PLGA支架纤维的降解有关。此外，据检测，在体外孵育90 min后支架中细胞贴壁的比例可达到83%，从而显示PLGA支架和脂肪源干细胞具有良好的相容性。研究还发现，PLGA支架对于脂肪源干细胞定向分化为软骨细胞具有一定的促进作用。

Kim等 [6]将脂肪源干细胞附着于PLGA微球上直接注射入裸鼠体内，结果发现，与单独注射PLGA微球相比，ASCs-PLGA复合物更有利于促进肌肉组织的再生，表明PLGA支架有助于脂肪源干细胞向肌肉组织的定向分化。

尽管PLGA已广泛用于组织工程的研究，但仍需进行改进，例如降解时间长、质地脆等缺点。对于其在临床的应用，还需观察其免疫原性，并进一步研究其在体内降解时间的调控等。

2.2　生物陶瓷支架

生物陶瓷主要由钙、磷组成，是骨组织中的主要无机成分，具有良好的生物相容性和骨传导性，植入骨断端易形成骨性结合。该材料可加工成多孔结构，有利于细胞长入和营养物质以及代谢产物出入。此外，其轻度溶解所形成的高钙离子层及微碱性环境，可有效促进成骨细胞的粘附、增殖和基质分泌，且该材料中的微量氟元素能促进成骨细胞合成DNA，并提高碱性磷酸酶的活性。因此，生物陶瓷主要应用于骨组织工程支架材料。

目前，脂肪源干细胞组织工程中应用较为广泛的生物陶瓷有钙磷盐陶瓷和生物活性玻璃（Bioactive glass，BG）。

其中，钙磷盐陶瓷主要包括羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、磷酸三钙（Tricalcium phosphate，TCP）以及双相钙磷陶瓷（HA/TCP）。HA具有多孔结构和骨诱导性，不仅可引导新生骨沿植入体界面向植入体内生长，而且能通过与接触的骨面形成磷灰石层而达到良好的骨性结合 [7]，常作为骨代用品广泛应用于临床。但其作为骨组织工程支架材料时，由于其降解速度非常慢，从而影响了新骨的长入和后期的构建。同时，它也存在着脆性大，柔韧性不够等缺点。TCP与HA最大的不同，就是它具有明显的生物可吸收性，属于生物可降解吸收的陶瓷类材料。尽管如此，由于其降解和吸收速度与骨形成速度不匹配，随着降解的进行，强度大幅度下降。

BG是硅酸盐性质的生物活性材料，主要成分包括SiO 2、Na 2O、CaO、P 2O 5等。它和骨组织及软组织之间具有良好的生物活性和生物相容性。BG表面部分在水溶液中可形成具有高表面积的水化氧化硅层及碳酸盐羟基磷灰石（HA）层，能诱导更迅速的骨修复与再生。此外，BG还具有良好的止血效果及抗菌能力 [8-9]。尽管如此，BG同样存在脆性大，抗弯强度差，以及其含有的硅成分不能降解等不足。

鉴于生物陶瓷材料在骨修复领域中的独特优势，国内外学者通过将其和有机高分子聚合物材料复合，利用各种复合材料在性能上互补，使生物陶瓷材料在骨组织工程骨修复领域得以推广应用 [10]。

Hao等 [11]将β-TCP和PLGA共聚物构建成多孔复合材料。研究发现，该复合材料的亲水性可随β-TCP成分的增加而增加，同时β-TCP的引入也可以代偿聚合物降解引起的pH值下降，有助于细胞粘附，防止无菌性炎症反应的发生；此外，PLGA共聚物也有助于改善陶瓷类材料的脆性，加强复合支架的刚性。该实验利用Ⅰ型胶原凝胶（CollagenⅠgel，COL）模拟骨细胞的细胞外基质，使兔脂肪源干细胞（Rabbit adipose-derived stem cells，rASCs）悬浮其中，然后种植到多孔PLGA-β-TCP复合支架中。结果发现，与单纯rASCs/PLGA-β-TCP组相比，在体外培养2周后，加入胶原凝胶组（rASCs-COL/PLGA-β-TCP组）的碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化程度都明显增高；体内移植8周后，加入rASCs-COL/PLGA-β-TCP组的钙化程度在影像学检测下很明显，且已有骨小梁形成，而单纯干细胞-复合支架组无明显钙化，且仅发现有骨样组织形成；此外，经检测，体内移植8周后，rASCs-COL/PL鄄GA-β-TCP组新骨形成的面积可达移植物总面积的42.31%，而rASCs/PLGA-β-TCP组却仅达7.88%。由此可见，加入Ⅰ型胶原后能够显著提高材料与组织细胞的相互作用，明显促进干细胞向骨细胞分化以及均匀骨组织的形成。

有研究发现，ASCs种植到BG支架后的3 h内无细胞死亡，2周后活细胞的比例更高，并且均匀粘附和分布在整个支架上，从而证明BG支架材料与ASCs具有良好的相容性 [12]。此外，BG支架具有有效促ASCs增殖和向骨细胞分化的作用，提示两者的结合在骨修复领域中具有巨大潜能。

Haimi等 [13]对PLA-β-TCP和PLA-BG复合支架对ASCs生存、分布、增殖和向成骨分化作用进行了比较。体外培养2周后，发现PLA-β-TCP复合支架上ASCs的DNA含量以及碱性磷酸酶的活性明显高于PLA-BG复合支架组，提示PLA-β-TCP在促ASCs增殖和成骨分化方面具有明显优势。

2.3　纳米支架

纳米材料是上世纪80年代兴起的，是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1～100 nm）或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料具有3个共同结构特点：①尺寸在纳米量级；②有大量的界面或自由表面；③各纳米单元之间存在着或强或弱的相互作用。由于这些结构上的特殊性，纳米材料具有一些独特的效应，包括尺寸效应和表面（界面）效应。

由纳米材料制造的组织工程纳米支架已经显示出非常诱人的前景。因为细胞与细胞的信息传递以及细胞的功能完成都与胞外的基质环境（ECM）密不可分，而组织工程纳米支架的ECM就是由非常复杂的纳米级纤维网络构成的，因此与天然ECM结构相接近的三维纳米纤维支架能够充分模拟体内微环境，从而具备生物功能，实现与肌体组织的完全整合。此外，纳米支架材料的比表面积巨大，能提供大量的细胞接触点，使单位体积内的细胞数量增加，并改善蛋白质吸附，有利于生长因子的释放 [14-16]。同时，研究还表明，与传统支架相比，纳米级的生物支架材料更有利于细胞的粘附、增殖、分泌和生长 [17]。

目前，纳米结构生物材料主要包括由纳米粒子直接构成的材料和通过特殊方法将表面处理成具有纳米结构的材料。这些纳米材料可以是无机的，也可以是有机的。

Lin等 [18]利用β-TCP和HA成功制备了可降解的纳米双相磷酸钙复合支架（β-TCP∶HA＝30∶70），并以此来检测纳米复合支架对ASCs向成骨方向分化的影响。结果发现，植入裸鼠体内4周后，在支架表面和多孔结构中开始出现骨样结构，并有大量的细胞外基质产生；8周后出现白色、质硬的骨样组织，且均匀分布于整个支架的腔隙结构中，并伴有大量的血管产生。而单纯纳米复合支架组移植后4周时未见骨样组织形成，且8周后出现的少量骨组织在腔隙结构中也呈不均匀分布。实验证实，纳米复合材料在形成多孔结构的同时能够明显改善支架的力学性能，且与ASCs相容性良好，同时也能促进ASCs的粘附、增殖和分化。

McCullen等 [19]同样证实由多壁碳纳米管和聚乳酸纳米纤维构建的静电纳米复合支架与ASCs具有良好的相容性，有利于干细胞的生长、增殖和分布。研究表明，ASCs种植到静电纳米复合支架后，14 d内均表现出良好的生长活性，并且在扫描电镜下呈均匀分布，而在单纯支架上则呈随机分布状态，这可能与纳米支架亚微米级的孔径有关。

虽然目前纳米纤维支架材料的制备和研究已经取得了一定的成果，但是如何优化制备工艺、缩短材料制备周期、降低材料加工成本、增强材料的安全性能、提高支架材料的孔隙率和控制孔径的大小及其分布等问题，还有待进一步的研究。

3　展望

近几年来，组织工程研究获得了很大发展，但种子细胞的来源尚受到诸多限制，而ASCs蕴藏着较好的临床应用前景。各种人工合成支架材料在脂肪源干细胞组织工程中的应用取得了很大的进展。随着生物学、细胞学及生物材料学等相关学科的发展，如何开发新型的仿生化、智能化组织工程材料，即通过分子设计以制备符合人体细胞外基质需要的，能对生理环境变化产生响应的，可在分子水平上激活基因诱导细胞组织分化，实现器官修复和组织修复的新一代生物可降解组织工程支架材料，是组织工程支架材料进一步发展所面临的挑战 [20-21]。因而需要进一步加强相关学科间的相互渗透、交叉和合作，在不断开发和改进组织工程支架材料的同时，更要注重细胞与生物材料相互作用的研究。