鸡囊胚细胞玻璃化冷冻保存技术的研究

邓 缘 洪亚辉 燕海峰 胡雄贵

摘要:研究不同冷冻液配方对鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻保存效果。对新鲜种蛋囊胚细胞分离提纯后,在DMEM中添加不同的冷冻保护剂DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、蔗糖,分别组成6种玻璃化冷冻保护液,进行超低温冷冻保存。复苏后通过苔盼蓝染色测定活细胞存活率。结果:玻璃化冷冻保存中,囊胚细胞在玻璃化冷冻液配方2(10%EG+10%DMSO+0.5mol/L蔗糖+20%FBS+DMEM)条件下复苏后存活率最高(71.32%),与玻璃化冷冻液配方1和3条件下复苏后存活率之间差异显著(P<0.05),且与玻璃化冷冻液配方4、5、6条件下复苏后存活率之间差异均极显著(P<0.01),可以作为鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻液。

关键词:鸡;囊胚细胞;玻璃化冷冻

中图分类号:S831.4+9文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)11-0007-03

随着超低温冷冻保存技术的发展,许多哺乳动物及一些濒危动物的种质细胞(精子、卵子和胚胎)都实现了超低温冷冻保存,玻璃化冷冻技术因其简便、快速、经济,减轻了胚胎冷冻中常见的冻伤现象,存活率提高,因此应用日益广泛[1]。本实验采用玻璃化冷冻鸡X期囊胚细胞,并探讨此方法对鸡胚胎复苏效果,为家禽种质资源保存做基础性研究。

1材料和方法

1.1实验时间和地点

实验时间:2009年2月至2009年4月。

实验地点:湖南省畜牧兽医研究所生物技术研究室。

1.2材料

1.2.1种蛋种蛋来自湖南省畜牧兽医研究所生物技术研究室饲养的白莱航鸡。

1.2.2主要试剂DMEM(高糖,Gibco)、FBS(胎牛血清,杭州四季青公司生产)、DMSO(二甲基亚枫,Sigma)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮,Sigma)、EG(乙二醇,Sigma)、Sucrose(蔗糖,Sigma)。

1.3方法

1.3.1鸡囊胚细胞的采集[2]在无菌环境中,将已消毒的种蛋打入培养皿中,使胚盘位置位于正上方。剪破并刮除胚盘上的浓蛋清,用消毒后的滤纸环轻轻贴在囊胚的位置,将粘有囊胚的滤纸环转入含PBS的培养皿。用头发环剔除蛋黄,切掉周围的暗区,保留中央的明区,再用 0.5% PBS清洗两次后待用。

1.3.2囊胚细胞玻璃化冷冻液和复苏液的配制冷冻液和复苏液的配制方法参考韩威等冷冻和复苏PGCs细胞的液体配制方法[3]。囊胚细胞慢速冷冻液由细胞悬液I和细胞悬液Ⅱ共同组成。细胞悬液I:DMEM+20%FBS;细胞悬液Ⅱ:无血清DMEM+冷冻保护剂(其中不同配方中,EG、DMSO和蔗糖的比例不同)。不同玻璃化冷冻液配方见表1。

1.3.3冷冻方法将PBS清洗过的囊胚细胞放入细胞悬液I中悬浮,轻轻吹打,同时缓慢加入等体积的细胞悬液Ⅱ,使其混合均匀。调整细胞密度为2～3×10⁷个/mL,开始装管。采用0.25mL精液细管装胚,按顺序依次吸入0.5mol/L蔗糖溶液(5cm),首先抽取细胞悬液Ⅱ2.5～3.0cm,然后抽吸1.5～2.0cm空气柱。之后抽吸含胚胎的玻璃化冷冻液1.5～2.0cm,尽量使胚胎位于溶液中段。再抽吸1.5～2.0cm空气柱。最后抽吸细胞悬液Ⅱ至冷冻麦管末端,用电加热镊子封闭麦管。随即浸入液氮中冷冻保存。

1.3.4复苏方法复苏液的配制:1.5mL离心管中加入1mL无血清DMEM液,再缓慢加入0.2mL FBS于离心管底部,制得解冻液,可见明显的分层,使用前37～38℃预热。

囊胚细胞复苏时,从液氮罐取出冷冻麦管,迅速投至37～38℃水浴中放置10s,用无菌剪刀剪开麦管两端,用注射器将冷冻麦管内胚胎缓慢的吹入复苏液的上层面,当细胞下沉到DMEM和FBS液面分界处,1 000r/min离心5min收集囊胚细胞沉淀,用细胞培养液悬浮囊胚细胞沉淀。

1.3.5细胞活率计算培养液中的悬浮囊胚细胞,转入6孔培养板中,细胞密度为2~3×104个/孔。37℃,5%CO2,饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养2h后,采用台盼蓝对囊胚细胞进行染色后,计数染色的死细胞数和未染色活细胞数,并计算细胞存活率,以同期未冷冻的鸡囊胚细胞作为对照。

1.3.6形态学鉴定用倒置显微镜,观察培养4h后的囊胚细胞生长、集落形成情况及集落的外部特征。

1.3.7数据处理实验结果用SAS V8.01统计分析软件进行数据处理,检验方法采用X2检验。

2结果与分析

2.1细胞活率和台盼蓝染色结果

采用不同玻璃化冷冻液冷冻,复苏后囊胚细胞的存活率结果见表2,从表2可以看出,囊胚细胞玻璃化冷冻复苏后,在冷冻保护液1和冷冻保护液3条件下的活率分别为65.65%、61.75%,两者之间差异显著(P<0.05);冷冻保护液2条件下的活率为71.32%,与冷冻保护液1和冷冻保护液3条件下的活率相比,差异极显著(P<0.01);同时发现,囊胚细胞复苏后在冷冻保护剂4、冷冻保护剂5和冷冻保护剂6条件下的活率分别为:35.73%、36.78%和30.31%,与前3种保护液(1、2和3)相比,差异极显著(P<0.01);而冷冻保护剂4和冷冻保护剂5条件下活率之间差异不显著(P>0.05);而冷冻保护剂6与冷冻保护剂4、冷冻保护剂5相比,差异显著(P<0.05)。复苏后囊胚细胞采用台盼蓝染色计算存活率(见图1)。

2.2形态学观察结果

复苏后的囊胚细胞采用加盖玻片方式接种培养,6h后观察到部分细胞呈现贴壁状。此时已表现贴壁特征的囊胚细胞开始相互融合。玻璃化冷冻复苏后的囊胚细胞培养8h内,仍具有较好的活性(见图2)。

3讨论

家禽遗传物质的保存形式主要有:①活体保存。②精液冷冻保存。③DNA的保存(cDNA文库、核苷酸序列数据库等)。④胚胎冷冻保存。其中,活体保存形式是禽类遗传物质保存的最可靠方式,但受资金、近交衰退和地方性疾病等因素的限制;精液冷冻保存,作为一种有效的种质细胞保存方式,仅是保存了成年公禽的基因组,而且复苏后精液受精率较低(50%～70%);以DNA形式保存的遗传物质,只是特定基因或整个基因组的一小部分;而禽类受精卵体积较大、结构和组分复杂、抗冻能力较弱且含有大量卵黄,难以实现冷冻保存。由于禽类生殖系统的特殊性,当鸡蛋产出体外时,鸡胚已经是拥有内外胚层的囊胚期细胞团(即X期囊胚)。1996年Pain等首次系统地阐述了X期囊胚含有潜在的禽胚胎干细胞,而用于转基因操作的PGCs细胞(原生殖细胞)来源于X期囊胚明区的中央带细胞群。X期细胞可以作为外源基因的载体,在嵌合体制备、转基因动物生产等研究中具有良好的应用前景。因此,应用玻璃化冷冻技术研究家禽X期囊胚细胞的冷冻保存方法,为禽类遗传资源多样性保存提供另一种可靠途径,同时也可以为囊胚细胞的体外遗传操作提供细胞来源。

玻璃化冷冻的基本原理是在细胞冷冻过程中添加高浓度的冷冻保护剂,固化脱水后直接投入液氮中,通过快速降温,形成玻璃态,避免胞内外冰晶损伤,并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化冷冻保存虽然在低温保存技术和低温生物学研究中起步较晚,但由于其良好的冷冻效果和潜在的发展前景而倍受关注,进展较快。

本研究用封闭的麦管玻璃化法冷冻保存鸡胚,和以往的慢速冷冻方法一样,胚胎和液氮完全隔离。囊胚细胞玻璃化冷冻的最低复苏率能达到57.73%,而最高复苏率达到了70.32%,证明冷冻剂配方是可行的。但与韩威等[3]研究的PGCs玻璃化冷冻复苏率比较略低,究其原因可能有如下几个:①冷冻程序的影响。细胞在玻璃化冷冻液中,平衡时间如果过短,冷冻剂渗透不足,会导致细胞内脱水不充分而形成内源冰晶,而如果时间过长,高浓度的冷冻保护剂又会对细胞产生毒性。在哺乳动物胚胎、卵母细胞的玻璃化冷冻方法[4~8]中,一般采用将冷冻物在常温下,依次放入浓度逐渐升高的玻璃化冷冻液稀释液中平衡,以达到固化脱水、避免高浓度冷冻液损伤的目的。因此本研究在玻璃化冷冻程序中,对平衡过程加以改进:在待冷冻鸡囊胚细胞悬浮处理过程中,分步加入细胞悬液Ⅰ和细胞悬液Ⅱ,混合形成最终浓度玻璃化冷冻液,此过程是囊胚细胞在冷冻剂浓度逐渐升高,最后达到最终浓度的玻璃化冷冻液中连续平衡的过程,目的在于保证冷冻剂DMSO和EG能够充分进入细胞内,由于温度较低,DMSO、EG对细胞的毒性也较低。虽然冷冻保护剂参考了韩威等针对禽类细胞的玻璃化冷冻液配制方法,但冷冻方法操作上,对装管过程中冷冻保护剂与囊胚细胞的接触时间和接触剂量较难控制。同时装管后的快速投入液氮降温,产生的“爆沸”情况,对冷冻效果有一定影响。②冷冻液的毒性和形成玻璃化能力的影响。玻璃化冷冻液的毒性和玻璃化能力,与其组成和浓度有关,本试验采用渗透性冷冻保护剂DMSO、EG单独或联合与非渗透性冷冻保护剂蔗糖组成玻璃化冷冻液。从试验结果看,玻璃化冷冻液2(10%DMSO+10%EG+0.5mol/L蔗糖)保护效果最好,表明DMSO、EG以及蔗糖对囊胚细胞是有效的玻璃化冷冻保护剂。冷冻液1与3、4与6相比,差异显著(P<0.05)或差异极显著(P<0.01),说明EG对囊胚细胞的玻璃化冷冻保护效应显著强于DMSO,高浓度的DMSO(20%)对囊胚细胞有一定毒性。而冷冻液2与1、3相比差异极显著,表明在高浓度的渗透性冷冻保护剂条件下,DMSO和EG的联合(10%+10%)在鸡PGCs细胞的玻璃化冷冻中起到了互补作用,既降低了DMSO在玻璃化冷冻液中的浓度,降低对细胞的毒性作用,又可以增强玻璃化形成能力。同时比较冷冻液1、2、3和4、5、6,发现低浓度的渗透性冷冻保护剂对囊胚细胞玻璃化冷冻保护不够,可能的原因是浓度低时玻璃化形成能力降低。③复温程序产生的影响。在胚胎、卵母细胞[4-8]等玻璃化冷冻复苏方法中,一般采用将复温后的冷冻物依次移入浓度逐渐降低的解冻液中稀释洗涤,除去高浓度的冷冻保护剂。本试验中复温后的囊胚细胞从解冻液上层面缓慢注入,细胞下沉至DMEM和FBS分界面处,这个过程是连续稀释洗涤的过程,既可以移出冷冻保护剂,又可以避免细胞内外渗透压的急剧变化,而分界面下层的FBS有助于复苏后PGCs细胞形态和功能的恢复[9],对细胞的复苏有一定的促进作用。

参考文献:

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