双重免疫荧光抗体法检测肾综合征出血热特异性抗体

贾 杰

检测血清中肾综合征出血热(EHF)特异性抗体的方法较多，但大都用间接免疫荧光法(IFAT)。本文在IFAT的基础上，加用第二荧光抗体(第三抗体)染色的方法——双重免疫荧光法，检测病人血清中EHF抗体，同时与IFAT比较，结果表明，双重荧光法检测EHF抗体敏感性高于常规法，特异性可靠，值得提倡应用，现介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

EHF细胞抗原片、EHFV抗原和FITC—羊抗人IgG(1:4稀释)均由浙江省疾病预防控制中心提供，批号分别为20060520、20060819和20060515。FITC—猪抗羊IgG为北京生物制品研究所产品，批号20060912，工作稀释度1:40。EHF病人阳性血清34份，其中23份为本市病人血清；另11份由天台县疾病预防控制中心赠送；本市疑似病人血清21份。

1.2方法

IFAT法按参考文献方法进行。双重荧光法参照张龙兴等所介绍方法进行。方法为：①待检血清置56℃水浴灭活30min。②将已灭活血清从1:20开始连续2倍稀释至1:2 560(稀释液为pH 7.2 0.01M/LPBS)。

③将各稀释度血清5μL按顺序分别滴加抗原片孔内，37℃湿盒30min。④用pH为7.2 0.01M/L PBS振荡轻洗2次(3～5min/次)，再用蒸馏水漂洗1次，吹干加FITC—羊抗人IgG，37℃湿盒30min。⑤取出后依照步骤④震洗，吹干后加FITC—猪抗羊IgG，37℃湿盒30min。⑥同前步骤PBS复洗吹干，用9:1甘油PBS封片后在荧光显微镜下检查。结果判断同参考文献。

1.3阻断试验方法

将待检血清与4单位EHFV抗原等量混匀，置37℃作用2h后，按1.2方法中②～⑥步骤进行测定。

2结果

2.1双重荧光法的重复性和特异性

本次对34份EHF阳性血清、19份伤寒病人血清、16份麻疹病人血清和30份正常人血清在不同时间内重复测定3次。34份EHF阳性血清中仅1份有1次抗体下降1个滴度，其余33份阳性血清抗体滴度均一致。其他病种病人血清和正常人血清标本3次检测均未出现假阳性，并对3份1:20滴度的血清作阻断试验，结果均为阴性，表明双重荧光法检测抗—EHF抗体良好的特异性和重复性，见表1。

2.2双重荧光法和IFAT两法结果比较

在对34份EHF阳性标本做双重荧光试验的同时用IFAT法进行比较。双重法检出的最低滴度为1:20(3例)，最高滴度为1:1280，几何平均滴度为1:192。IFAT法测出最低滴度为1:20，最高滴度为1:640，几何平均滴度为1:85。从两法最低检出滴度看，敏感性似乎相似，但在阳性数上双重荧光法为3例，IFAT为5例，说明有2例IFAT法的敏感度较双重荧光法低，再从1:40稀释阳性例数上分析，双重法较IFAT法高出2例，这其中可能包含了IFAT法1:20中的2例，但有1例IFAT法滴度高于双重荧光法。两法检测抗体几何均数经t检验差异有统计学意义(t=3.269，P＜0.01)，见表2。

2.3两种荧光法检测EHF疑似病人血清中抗体

用两法同时对21例疑似病人血清进行检测，双重荧光法阳性检出率为76.19％，而IFAT法为66.67％，前者较后者高8.52％。两法阳性一致者14例，均阴性5例。而双重荧光法阳性、IFAT法阴性者2例，未见IFAT法阳性而双重荧光法阴性的例数。两法检出结果按确切概率法计算，P=0.002，差异有统计学意义。见表3：

3讨论

双重荧光法应用于EHF样本的检测，本实验进行初步应用和探讨。结果表明，双重荧光法在抗体滴度敏感性和阳性检出率上分别较IFAT法高2～8倍和8.52％，两法检测敏感度有统计学差异(P=0.01)。而从对2例双重荧光法阳性、IFAT法阴性的样本的阻断试验、30例正常人样本的检测结果中，显示了双重荧光法的可靠特异性。显然双重荧光法对一些临界弱阳性标本可提高阳性检出率，弥补IFAT法对这些标本的漏检，对EHF的早期诊断、流行病学调查研究有重要价值。双重免疫荧光法在EHF抗体的检测中值得进一步研究和应用。