生防细菌Ｂ５７９的活性稳定性及其对作物安全性研究

杨秀荣等

摘要：通过对生防细菌B579的活性稳定性及对作物安全性研究，结果表明，生防细菌B579能够保持稳定的生防效果，同时对作物安全。

关键词：生防细菌；活性稳定性；安全性

中图分类号：s 476，19

天津市植物保护研究所生防室从天津近郊蔬菜种植区分离筛选获得1株生防细菌B579，经初步鉴定为芽孢杆菌属，试验表明该菌无论是室内平皿抑菌试验还是温室盆栽试验对土传病害表现出明显的防治效果，为了将其进一步开发成生物产品应用于农业生产，笔者对该菌的生防活性稳定性及其对作物安全性进行了初步研究。

1、材料与方法

1.1试验菌种

生防细菌B579从津郊蔬菜种植田分离获得，现保存于天津市植物保护研究所生防室。立枯丝核菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、茄子枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌5种土传病原菌由天津市植物保护研究所生防室、病害室分离保存。

1.2培养基

(1)PDA培养基：马铃薯200 g；葡萄糖或蔗糖20 g；琼脂18 g；蒸馏水1 000 mL。

(2)肉汁胨培养基：牛肉浸膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1 000 mL；pH 7.2。

(3)LB培养基：蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；蒸馏水1 OOO mL；pH 7.2。

1.3生防细菌B579活性稳定性测定

采用平皿试验，将生防细菌B579在牛肉胨培养基上连续转接5代(每隔7天转1次)，每代都对以立枯丝核菌、禾谷镰刀菌、茄子枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉5种土传病原菌为靶标菌，进行抑菌测定。首先将病原菌用打孔器制成直径为5 mm的菌片，用接种针将该菌片挑取于PSA平板的边缘，然后将生防细菌B579接种在PSA平板中央，培养不同时间后(立枯丝核菌为24 h，其他病原菌为3～4 d)测定病原菌的半径，然后按照公式抑菌率＝(病原菌半径－对照半径)／对照半径计算抑菌率。

1.4生防细菌B579菌体形态观察

将B579在LB液体培养基中振荡培养24、30、48、72 h(培养温度为27℃，转速为150 r/min)，然后分别离心(3 000 r/min、3 min)，再用无菌水洗脱2～3次，经电子染色后在透射电镜下观察菌体形态。

1.5生防细菌B579对烟草过敏性反应测定

将浓度为10⁸cfu／mL的细菌悬浮液0.2 mL注射在烟草叶片的细胞间，然后将烟草置于温室中，常规管理，24 h后调查烟草的过敏性斑枯反应，同时以番茄青枯病菌作对照。若烟草叶片上出现黄化、斑枯现象说明该细菌具有致病性，若未出现上述反应则为非致病菌。

1.6生防细菌B579浸泡种子不同时间对黄瓜发芽的影响

取生防细菌B579的发酵培养液10 mL(菌浓度为10⁸cfu／mL)浸泡黄瓜种子，分别浸泡4、8、12、16、18 h，然后将种子分别放置于铺有双层滤纸的灭菌平皿中，每天向平皿中加5 mL无菌水保湿催芽(25℃)，36 h调查黄瓜芽长。

1.7生防细菌B579对黄瓜生长的影响盆栽试验

本试验设4个处理，处理a：用生防细菌B579浸泡黄瓜种子6 h，然后播种于营养钵中，处理b：采用清水浸泡黄瓜种子6 h后播种(作为处理a的对照)。处理c：采用生防细菌培养液直接浇灌于营养钵的土壤中，然后播种。处理d，采用清水浇灌土壤，然后播种(作为处理c的对照)。

2、结果与分析

2.1生防细菌B579活性稳定性

2.1.1生防细菌B579对病原菌的抑制作用

生防细菌B579在连续转接5代后，对土传病原菌的抑菌活性基本保持不变，效果稳定，结果见表1。

2.1.2生防细菌B579菌体形态的观察

透射电镜观察表明，B579在LB液体培养基上培养24 h时，96％为营养体，4％已产生芽孢，培养30 h时，60％为营养体，40％已产生芽孢，培养48 h时，仅有5％营养体细胞，95％为芽孢体细胞，培养72 h后，培养基中营养体细胞全部破裂死亡(图1)。此外，由照片可知生防细菌B579的形状为杆状，鞭毛多根周生，芽孢椭圆形，端生，为芽孢杆菌属。

2.2生防细菌B579对作物安全性研究

2.2.1生防细菌B579对烟草的过敏性反应

接种24 h后调查结果表明，生防细菌B579在注射孔周围对烟草没有产生任何影响(图2)，叶片生长正常，而注射番茄青枯病菌的处理在针孔周围出现褪绿黄化现象(图2b)，后期叶片枯死。试验结果说明，生防细菌B579对烟草未产生过敏性反应。

2.2.2生防细菌B579浸泡时间对黄瓜发芽的影响

B579浸泡黄瓜种子不同时间对黄瓜发芽的影响，结果见图3，由图3可以看出，用高浓度的拮抗细菌菌液分别对黄瓜种子浸泡4、8、12、16、18 h，然后进行催芽，各处理黄瓜的芽长均比清水对照长，浸泡12 h处理的效果好。

2.2.3生防细菌B579处理对黄瓜发芽的影响

由表2可以看出：生防细菌B579对黄瓜浸种处理后，黄瓜平均出苗率为90％，平均株高为13.8 cm，与对照比分别增加13.9％和11.3％，而先用生防细菌浇灌土壤后再播种，黄瓜平均出苗率为88％，平均株高为11.9 cm，与对照比分别增加10.O％和7.2％，因此，两种处理都有不同程度的促生作用(图4)，但浸种的效果要比土壤处理的效果好。

3、讨论

将生防细菌B579连续转接5代，每代对5种土传病原菌都能保持稳定抑制效果，此外该菌在LB培养基中培养72 h后，全部以芽孢体形式存在，因此作为生防菌能够保证稳定的生防效果。

生防细菌B579接种于烟草叶片，对烟草未产生任何斑枯或黄化反应；接种于大白菜内，没有引起白菜的腐烂；浸泡黄瓜种子，黄瓜发芽率及株高明显高于对照，因此表明生防细菌B579无致病性，对作物安全。