蜂胶对力竭游泳运动小鼠的免疫功能的影响

庞阳康

摘要：目的：探讨蜂胶对力竭游泳运动小鼠免疫功能的影响。 方法:38只小鼠随机分为两组蜂胶组和对照组，都进行力竭游泳训练，蜂胶组采用0.1 mL／lOg·bw剂量的蜂胶给小鼠经口灌胃30 d，分别测定免疫器官脏器／体重比值，进行外周血白细胞、淋巴细胞、外周血T细胞亚群（CD₈+%、CD₄+%、CD₄+/CD₈+）的测定。结果与对照组比较，蜂胶能明显提高小鼠的CD₄+%、CD₄+/CD₈+、胸腺体重比值。 结论：蜂胶具有增强力竭游泳小鼠免疫力的作用。

关键词：蜂胶; 力竭游泳运动;免疫

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)03-0353-03

免疫功能与运动的关系越来越引起人们的重视，普遍认为体育锻炼可以提高机体的抗氧化能力提高免疫参数，增强机体吞噬细胞，自然杀伤细胞的活性，防止感染的发生［1］。但大量研究表明过度训练或运动会引起机体免疫功能下降。过度运动包含两方面的意义：一是运动负荷超过机体的承受能力，机体在精神、能量方面的过度消耗，导致免疫机能下降；二是指机体在身体机能正常情况时所承受的运动量和强度，当机体的某些机能发生改变时，如连续大运动量训练时恢复手段无效、营养不良、情绪突变和思想波动等，使正常的负荷变成超量负荷，主动运动变为被动运动，导致机体免疫机能下降［2］。因此，不同运动量对免疫系统产生不同的影响。因此寻找有效的方法防治过度训练引起的机体免疫功能下降, 意义重大。

蜂胶是蜜蜂采集植物树脂，并混入蜜蜂唾腺分泌物及蜂蜡、花粉等经加工而成的一种粘稠物质［3］。从药学角度看，蜂胶是一味动、植物双性的中药，芳香，味苦，酸、甘、平，含有蛋白质、糖类、酶类、花粉、无机盐类等。从化学结构和成分来看，蜂胶含有20余类、300多种天然成份，其中包括30多种人体必需的微量元素、20种氨基酸、数埂种芳香化合物70多种黄酮类物质，还有丰富的有机酸、菇烯类物质、维生素、木脂体、酶类多糖等具有生物活性的天然成份［4］。近年来研究表明，尽管不同地区蜂胶化学成分相差很大，但是它们具有相似的生物学活性［5］。从生物学活性角度看蜂胶具有抗菌消炎、抗病毒、抗真菌、排除毒素、增强免疫力、软化血管降低血脂、净化血液、改善微循环、抗氧化、调节免疫功能［6］。本文从生物学的角度研究了蜂胶对小鼠的免疫功能的影响。我们以小鼠游泳训练模型研究蜂胶对运动小鼠免疫器官、和相关免疫指标的影响, 为蜂胶的研制、开发提供实验依据。

1材料

1.1实验动物

选用50只体重(17.85±2.25)g，鼠龄8周，健康雄性昆明种小鼠（由广东医学院动物中心提供），在安静、室温条件下喂养，国家标准啮齿类动物饲料，每天定时通风。分笼饲养，鼠笼规格25 cm×15 cm×18 cm，每笼5 只，分组前进行一次性游泳训练1 h，出现溺水或运动能力不足者予以剔除。筛选出的38只适应性喂养一周后随机分为两组进行试验。

1.2实验仪器小鼠恒温游泳缸，超净工作台，电子分析天平（型号GS223，日本SHINKO新电子天平）流式细胞仪(Beckman coulter cell 型号 Cell Lab Quanta SC)光学显微镜，恒温箱，离心机，血红蛋白吸管，眼科剪，普通剪刀等。

1.3实验试剂及方法受试的蜂胶样品来源于北京某蜂产品企业，其性状为棕褐色油性膏状物。试验时按所设剂量取样品加植物油配制所需浓度，分别给受试动物灌胃，灌胃体积为0.1 mL／lOg·bw，溶剂对照组给予等体积植物油，每天灌胃1次,一直到实验结束共60 d。其他还有三氯乙醛，肝素，生理盐水等。

1．4实验模型制备

1.4.1动物分组筛选后的动物（38只小鼠）按体重随机分为2组，常规喂养，喂养时间为8 周，适应性喂养1 周，适应性运动训练1 周，Ⅱ组即蜂胶组小鼠灌胃（ig）8周。Ⅰ组：对照组：选20 只小鼠，以生理盐水0.1 mL/10 g/日灌胃。

1.4.2运动条件游泳缸直径70 cm，水深40 cm，水温30℃左右，密度50 cm2/只。

1.4.3运动方式Ⅰ、Ⅱ组均进行负重游泳运动。在整个实验过程中使每只小鼠四肢不停运动，如果小鼠漂浮在水面停止活动，可用木棒在其附近轻轻搅动使之继续活动。负重方式：在小鼠尾部系上施加相当于自身体重4%的负荷的铁片。

1．4．4运动方案以1 周为1 单元，每只小鼠每周训练5 次，周末休息。Ⅰ、Ⅱ组：第1～3 d适应性游泳30 min，第4～6 d每天递增10 min 逐渐延长至60 min，第7 d休息，然后每天以60 min 游泳1 次。适应性训练1周后，对小鼠进行力竭性游泳训练（在小鼠尾部附加相当于自身体重4％的负荷），每天1次， 每周5次，持续8周。

1.4.5力竭判断标准按Dawson 法［7］1) 小鼠游泳动作明显失调（划水频率极其缓慢，连续下沉），不能再坚持；

2) 沉入水底8 s不能回到水面；

1.5样本采集于运动后即刻,用三氯乙醛腹腔麻醉,腹主动脉取血3 mL,肝抗凝。静置30 min后2 500转/min离心10 min,取上清液体保存于小试管中, -20℃冻存待测。然后称重后处死小鼠,取出胸腺和脾脏。

1.6指标的测试和方法脾指数和胸腺指数的测定:

分别采用称重法, 测量仪器为日本SHINKO新电子天平，型号GS223。具体方法: 称量小鼠体重(g) 后处死小鼠,取出并称量脾脏(mg) , 胸腺(mg) , 分别计算脾指数和胸腺指数, 脾指数= 脾重/体重(mg/ g) , 胸腺指数= 胸腺重/体重(mg/g)。

外周血WBC、淋巴细胞数量的测定：

取20 μL全血，放入事先加好血细胞稀释液试管（1∶200 稀释），用Culltae MEK-6318K 血细胞分析仪（日本光电公司制造）测定WBC、淋巴细胞数量。

T淋巴细胞亚群的测定：

取25 μL肝素抗凝血，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠CD4或CDsMcAb(购自美国Pharmingen公司)33 μL(pH7．2的PBS对倍稀释)，混匀，事温孵育30 min，加入750 μL双蒸水于抗凝血中溶血，混匀后再加入750 μLpH7．2的PBS稀释血液，流式细胞仪(Beckman coulter cell 型号 Cell Lab Quanta SC)检测小鼠外周血CD₄+T、CD₈+T淋巴细胞的百分率(各检测5 000个细胞)，测定结果采用Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。

1.7统计学处理所有数据用SPSS 10.0 统计软件进行处理,数据用均数±标准差来表示,采用t检验。

2结果

2．1蜂胶对小鼠外周血WBC 和淋巴细胞的影响由表1可见，单纯训练组即对照组的大鼠外周血WBC和淋巴细胞数值与文献参考值［7，8］相比较低，提示大强度力竭运动可能造成免疫功能下降。补充蜂胶组的WBC、淋巴细胞数值均接近文献中的正常小鼠数值，但各组之间无统计学差异。

2.2蜂胶对小鼠外周血T细胞亚群的影响表2显示实验组小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄+/CD₈+与对照组相比出现显著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出现明显变化,提示长时间大负荷游泳训练能降低小鼠外周血CD₄+百分比和CD₄+/CD₈+比值, 从而抑制小鼠T细胞免疫功能, 蜂胶能提高运动小鼠外周血D4+百分比、CD₄+/CD₈+比值, 从而具有抵抗力竭游泳训练对T淋巴细胞免疫功能的抑制作用。

2．3蜂胶对小鼠的脏器/ 体重比值的影响

表3显示实验组与对照组的脾脏/ 体重百分比无显著差异。胸腺/ 体重百分比试验组出现了显著增加，提示蜂胶可抵抗长时间力竭游泳训练引起的机体免疫器官的损伤。

3讨论

现有大量研究已证实不同的运动对免疫系统的影响并不一致。反应免疫系统变化的方法和指标很多，主要免疫指标包括免疫细胞、白介素、免疫球蛋白、细胞因子等［9］。

关于运动和免疫的关系，目前的研究很多，得出的结论也各有不同，目前达成共识的是：适度的运动可增强机体免疫力,而过度或激烈运动则会产生较多自由基，进一步降低机体免疫力。因此,如何减轻过度训练引致的机体免疫力下降、提高机体抗氧化的免疫功能成了研究热点［10］。

胸腺和脾脏属于机体免疫器官, 在T 细胞发育、成熟和T、B 细胞发挥免疫监控过程中发挥重要作用。研究表明过量运动会损伤机体免疫器官, 导致脾脏和胸腺重量降低,并发生结构的变化, 使器官的免疫反应降低。［11］本研究结果亦提示长时间大负荷训练会降低胸腺、脾脏重量, 而蜂胶可抵抗长时间大负荷训练引起的机体免疫器官的损伤。但我们的研究结果显示蜂胶组的胸腺/体重比之增大，而脾脏/体重比值无明显变化，相关机制尚不清楚。考虑可能原因是8周月龄小鼠胸腺组织尚未退化，对蜂胶的刺激反应强烈 ，而脾脏组织属外周淋巴器官，其变化需要较长时间用药才能表现出来。

T 淋巴细胞按表型不同分为CD₄⁺ 、CD₈⁺两大亚群, 根据分泌细胞因子的不同又分为I 型T 细胞(Thl 和Tcl ) 和Ⅱ型T 细胞(TH₂和Tc2) 两大亚群［12］。大量研究表明过量运动会导致外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺ /CD₈⁺比值降低,从而抑制机体的细胞免疫反应［13～15］。本研究结果亦提示长时间大负荷训练会降低机体外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺/CD₈+比值而对CD₈⁺百分比影响不大,可能与过量运动引起血浆皮质醇和细胞因子IL-6的升高,从而刺激CD₄⁺细胞等有关,我们的研究显示实验组小鼠外周血CD₄⁺百分比、CD₄⁺/CD₈⁺与对照组相比出现显著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出现明显变化,提示长时间大负荷游泳训练能降低小鼠外周血CD₄⁺百分比和CD₄+/CD₈⁺比值,从而抑制小鼠T细胞免疫功能,蜂胶能提高运动小鼠外周血D₄⁺百分比、CD₄+/CD₈⁺比值,从而具有抵抗力竭游泳训练对T淋巴细胞免疫功能的抑制作用，需要指出的是。胸腺是产生免疫的中枢淋巴器官，使免疫细胞法分化的场所，主要功能是产生T细胞和分泌胸腺因子，发挥细胞免疫功能，所以，蜂胶能提高运动小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄⁺/CD₈⁺比值也和蜂胶可抵抗长时间大负荷训练引起的机体免疫器官的损伤，增加胸腺的百分比有关［16］。

对照组的大鼠外周血WBC和淋巴细胞数值与文献参考值相比较低，提示大强度力竭运动可能造成免疫功能下降。补充蜂胶组的WBC、淋巴细胞数值均接近文献中的正常小鼠数值［7，8］，但各组之间无统计学差异。许多学者对不同训练后白细胞和淋巴细胞数量的改变进行了研究。一次急性训练，运动时间少于3 h，在中等强度和大强度运动中及运动后即刻，白细胞和淋巴细胞均出现10％～20％不同程度的下降［17］，我们的研究也表示蜂胶能够使WBC、淋巴细胞数值在大强度训练后不至下降得过低。

目前，已从蜂胶中分离鉴定出的成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醇类、酚类、醚类、有机酸和大量氨基酸、酶类、维生素B1、维生素H2、维生素B6、维生素E和维生素A以及矿物质等。其中分离鉴定的黄酮化合物有30余种，包括白杨素、柚柏杨素、芹菜素、金合欢素、槲皮素、芦丁、山奈酚等，蜂胶大部分的生理及药理功能都与此类化合物有密切关系。化学研究表明，产地不同的蜂胶尽管化学成分不同，但都不同程度地含有大量黄酮类化合物［18］。

有研究者用蜂胶乙醇提取液(其主要成分为蜂胶黄酮)给免疫力低下的小鼠灌胃，发现能增强小鼠的抗体生成细胞活性，提高溶血素的含量，增强单核一巨噬细胞碳廓清能力［19］。由此，我们推测蜂胶增强小鼠免疫力可能是黄酮类物质发挥了主要作用。可能是黄酮类物质作用于机体免疫器官一胸腺，刺激其产生T细胞，或是激活巨噬细胞、T细胞、B细胞 从而使其发挥免疫功能。我们的实验结果也证明蜂胶能增强小鼠的细胞免疫能力，和免疫器官所占百分比。李淑华等对免疫功能低下模型鼠细胞免疫功能的研究,用单克隆抗体技术检测实验小鼠药物处理前后T细胞总数及亚群变化,用MTT法检测T细胞增殖,结果显示蜂胶能促进ConA诱导的淋巴细胞增殖,增加T细胞总数并调整T细胞亚群紊乱［１９］,证明EEP对免疫功能低下小鼠细胞免疫功能具有免疫刺激和调节作用。提示,大运动量训练后运动员可以通过服用蜂胶来调节其T细胞亚群和增加T细胞总数以改善机体的免疫功能。

综上所述 国内外研究证明:蜂胶具有其本身没有抗原性,但可起到免疫佐剂作用;可以增高丙种球蛋白的效应,激活巨噬细胞,增强脾淋巴细胞的增殖能力,提高血清溶血素(抗体积数)含量,增加T细胞总数,调整T细胞亚群紊乱;它既能增强抗体形成细胞的功能活性,促进机体增加抗体产生,又能增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性,具有免疫刺激和调节作用,提高机体的特异性和非特异性的免疫功能［2０］。我们的研究也证明了这一点，因此,在长时间、大强度训练或比赛期间运动员服用蜂胶会对改善其运动疲劳或过度疲劳后免疫功能有一定的效能或具有一定的辅助治疗作用。

本文仅从动物实验的的角度来探讨其提高大强度运动后免疫能力的可能机理,以起到抛砖引玉的作用。 但蜂胶的组成成分是一个非常复杂的复合体，要明确某种成分起何种生物学作用，还需要作大量的实验研究工作。至于其生物学作用机理，更是有待于进一步探讨。

参考文献：

［1］ Mohammad A, et al. Influence of exercise on the immune function of rats of various ages［J］. J App l Physiol, 1988, 64 (5) :1997-2001.

［2］ Pedersen BK, et al. Exereise and the immune system-influence of nutrition and ageing［J］. J Scimed Sports,1999,2(3):234-252.

［3］ 王玉芬．蜂胶的研究进展［J］．河北医药，2002，24(3)：227 228．

［4］ 于英君，李淑华，郭丽新，等．蜂胶的生物学活性与临床应用［J］．中医药信息，2002，19(I)：27-28．

［5］ 乞永艳,骆尚骅,刘富海,等. 蜂胶抗氧化作用研究进展［J］.蜜蜂杂志,2000,12:3-5.

［6］ Racusen L. Alterations in human p roximal tubule cell at tachment in response to hypoxia: role of microfilaments［J］.J LabClin Med, 1994, 123:357-364.

［7］ 魏泓．医学实验动物学［M］．成都：四川科学技术出版社，1998：321-322．

［8］ 孙敬方．动物实验学［M］．北京：人民卫生出版社，2001：465．

［9］ 陈佩杰.急性运动对机体免疫的影响［J］.上海体育学院学报, 2000,24(1):

［10］ 矫玮.剧烈运动对机体免疫功能的影响以及检测与调节方法的研究［M］.北京:北京体育大学出版社,2003:135-138.

［11］ Mackinnon,LT.Current challenges and future expectations in exercise immunology:Back to the future,Med,Sci.Sports.Exer.1994,26(2):191-194.

［12］ Espersen GT,Elbaek A,Ernst E,et a1.Effect of physical exercise on cytokines and lymphocyte subpopulations in human peripheral blood.APMIS,I990,98(5):395-400.

［13］ Tvede N,et al.Evidence that the effect of bicycle ezercise on blood mononuclear Cellproliferative responses and subsets is mediated by epinephrine［J］.Int J SportsMed, 1994, 156:10.

［14］ Nieman.DC.Exercise, uppern respiratory tract infection ,and the immune system［J］. Med. Sci.Sports.Exer,1994，26(2):128-139.

［15］ Brines R,Hoffman-Goetz L,Pedersen BK.Can you exercise to make your immune system fitter?［J］.Immunol Today,1996,17（6）:252－254.

［16］ Mackinnon LT,et al.Plasma glutamine and upper respiratory tract infection during overtraining in elite swimmers［J］..Med Sci Sports Exerc,1996,28:285-290.

［17］ Shinohara R，Ohta Y，Hayashi T，ct a1．Evaluation of antilipid peroxidative action of propolis ethanol extract［J］．Phytonther Res，2002，16： 340，347.

［18］ Chopra S ,Pillai KK,Husain SZ ,etal. Propolis protects against dotorubicin - induced myocardiopathy in rats［J］. Exp Mol Pathol,1995,62 :190 -198.

［19］ 于晓红,李淑华,李树伟，等.蜂胶对小鼠免疫功能影响的试验研究［J］.中医药学报,2001,18(4).

［20］ 李淑华，于晓红，于英君，等．蜂胶对免疫功能低下模型鼠细胞免疫功能的影响［J］．中医药学报，2001，29(3)：38．