红螯螯虾白斑综合征的研究进展

张成硕 陈永成 马晶晶 管晓陈

摘 要：综述了红螯螯虾白斑综合征在中国的流行情况及研究进展，包括在红螯螯虾白斑综合征流行病学、检测技术、病理学及免疫预防等方面的研究工作。

关键词：红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）；白斑综合征；进展

中图法分类号：S917.4

红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）是一类在淡水中生活繁殖的虾类品种，属十足目，拟螯虾科，滑螯蝦属，原产于澳大利亚北部，在新几内亚也有分布，故又名澳洲淡水龙虾[1]。红螯螯虾成熟个体大，营养丰富，味道鲜美，市场接受度高，是目前世界上名贵的经济淡水虾种之一[2-3]。上世纪90年代初，我国湖北省水产研究所从澳大利亚首次引进红螯螯虾，并在湖北、广东两地试养成功，随后逐渐推广到湖南、江苏、浙江等地[4]。现如今，我国红螯螯虾的养殖已成规模，产量不断增长，发展前景广阔。

随着红螯螯虾养殖业的快速发展，各类病害的传播速度也迅速增加，养殖过程中红螯螯虾疾病的发生日益严重，目前主要存在寄生虫病[5-7]、细菌性病[8]和病毒病[9-10]。其中造成红螯螯虾大量死亡的白斑综合征（White spot disease， WSD）时有发生，因其传播速度快、死亡率高和防治困难等特点，对红螯螯虾养殖业造成严重经济损失，严重影响红螯螯虾养殖的健康持续发展。近几年国内也有若干涉及红螯螯虾疾病的文献，其中也涉及到了白斑综合征及其防治，但大多没有深入分析[11-12]。因此，本文聚焦红螯螯虾白斑综合征的发生情况及其研究进展进行探讨，以期为红螯螯虾健康养殖提供理论依据。

1 白斑综合征概述

白斑综合征是水产动物养殖中常见的一种病毒性疾病，其病原体为白斑综合征病毒（White spot syndrome virus， WSSV），虾类感染后的典型症状为头胸甲处出现针眼大小不规则的白色斑点，故又称为白斑病。白斑综合征病毒是线性病毒科（Nimaviridae），白斑病毒属（Whispovirus）下唯一的病毒[13]，其基因组大约有300 kbp，属于双链环状DNA病毒。WSSV无包涵体包被，由外到内的结构分别为囊膜、被膜层、核衣壳，电镜观察下的病毒粒子一端具有尾巴状结构，纵切面呈椭圆形，具体形态如图1所示[14]。白斑综合征首次于1992年在中国台湾的对虾养殖场内发现，随后日本、东南亚、美洲和欧洲地区也遭受其袭击，而且WSSV不仅在对虾科虾类中传播，蟹和鳌虾类等其他甲壳类动物也会受到其感染，这严重威胁了全球水产养殖业的发展。鉴于WSSV几乎能够感染所有的养殖甲壳类，早在1995年联合国粮农组织（FAO）就将白斑综合征列入必须报告的水生动物病毒性疾病名单中[15]。

2 红螯螯虾白斑综合征在中国的流行情况

红螯螯虾自引入中国后，人工养殖的历史较短，养殖初期由于规模较小和红螯螯虾本身较少携带病毒等原因，几乎未见白斑综合征发病。但2004年黄茹等[16]研究证明，无论是人工注射还是投食带毒饲料，WSSV均能够有效感染红螯螯虾并致其死亡。同年，沈锦玉等[10]在江苏某养虾场内的红螯螯虾与南美白对虾混养池或单养池中，首次发现并鉴定了红螯螯虾自然感染WSSV后死亡，死亡率达到50%。与此同时，浙江慈溪某养殖场内的红螯螯虾也发生了大量死亡，死亡率高达80%，经检测后证实是由WSSV感染造成的。2005年浙江嘉兴又爆发了红螯螯虾白斑综合征，死亡率为30%。自此之后，同样的事例在红螯螯虾各个养殖区内均有发生。

3 红螯螯虾白斑综合征的研究进展

3.1 流行病学的研究

3.1.1 病原的确定 1997年，Richman等[17]在螯虾属中发现了一种非常类似WSSV的致命病毒，后来Shi等[18]通过人工感染实验证实了红螯螯虾是WSSV的潜在宿主。沈锦玉等[10]对江苏省某养虾场内的发病红螯螯虾进行核酸探针斑点杂交鉴定和病原感染健康红螯鳌虾，核酸鉴定结果显示，探针与血淋巴、鳃组织产生强烈的阳性反应；健康虾经人工注射患病虾的组织上清液后全部死亡。病毒测序结果比对后发现与WSSV中国株（AF332093）的基因具有100%的同源性，从而证实了感染红螯螯虾的病毒是白斑综合征病毒中国株。

3.1.2 发病症状 与对虾白斑综合征具有明显的白斑症状相比，红螯螯虾白斑综合征病毒不会引起红螯螯虾的头胸甲出现明显白斑，腹部甲壳及附肢也无明显症状。其他症状主要包括以下几点：①患病虾游动迟缓，活力降低，螯肢无力，反应迟钝；②病虾厌食，空胃，出现蜕壳受阻现象；③病虾血淋巴不凝固、微红，肝胰腺颜色变淡；④病虾尾部肌肉白浊，内脏存在积水，出现断肢等现象；⑤发病死亡过程中是大规格虾先死，小规格虾后死。体重30～40 g的成虾患病后死亡率达80%[11-12，19]。

3.1.3 感染途径 大多数情况下，病毒的传播主要通过消化道和表皮创口等方式。随着水产养殖的发展，WSSV在自然水体和养殖水体中广泛存在，野生和养殖红螯螯虾在进行呼吸作用、迁徙和摄食携带病毒的病虾残体时都可能会感染WSSV。因而红螯螯虾与其他虾类混养时易受到其他虾类的病毒感染，单养池中红螯螯虾暴发白斑综合征极有可能是水环境中存在其他WSSV宿主。研究发现，红螯螯虾通过人工注射和口服均能感染WSSV，其中鳃细胞和血细胞是WSSV的主要靶细胞，濒死试验虾的鳃和血细胞中能够发现大量的病毒颗粒[20]。黄家骏[21]研究发现，WSSV经过酸化后，通过网格蛋白参与介导的内吞途径入侵到红螯螯虾的造血组织细胞中，而且此过程需要缢断蛋白（dynamin）和细胞膜上胆固醇的参与。首先WSSV与细胞膜表面多种识别受体相结合，囊膜蛋白在这一过程中起到了重要作用[22]。其中囊膜蛋白VP28和VP31能够识别细胞膜表面的LR受体[23-24]，VP24、VP32能够识别CPB受体[25-26]，这些囊膜蛋白与受体结合加速了病毒的入侵。通过内吞方式侵入宿主细胞后，WSSV进入细胞核内进行DNA的复制，然后组装下一代病毒粒子，最后释放出去[27]。

3.2 WSSV检测技术

自白斑综合征发现以来，不少科研人员就开展了WSSV检测技术的研究，快速且准确地诊断出白斑综合征病毒在生产实践中格外重要。由于红螯螯虾患白斑综合征后体表不具有明显白斑特征，目前在红螯螯虾中检测WSSV较为准确的方式为PCR检测。传统对虾WSSV的PCR检测通常需要提取病毒DNA，这一步往往会受到环境污染从而对结果产生影响。在对传统方法改进后，王轶南等[28]通过制备抗WSSV的混合单克隆抗体标记鳌虾血细胞中的病毒，然后应用流式细胞仪分析血细胞的感染程度；周小燕等[29]采用的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）法检测WSSV的灵敏度比巢式PCR要高约500倍；荧光定量PCR技术能够检测到宿主感染病毒后组织中WSSV数量的时序动态变化[30]；黄家俊等[31]根据蛋白序列制备单克隆抗体后利用免疫荧光研究WSSV的感染机制。另外需要注意的是，PCR检测中WSSV特异性引物要选择准确，世界动物卫生组织公布的一组引物可能会产生假阳性的结果，在实际应用时要避开使用[32]。

3.3 病理学研究

血液病理研究是病理学研究的重要组成部分，研究WSSV对红螯螯虾血细胞的感染特性，对了解WSSV致病发生机理和诊断治疗具有重要意义。已有研究表明，血细胞和造血组织（Hematopoietic tissue， HPT）细胞更易受到WSSV的感染，并且WSSV能够诱导血细胞发生凋亡[33]。王丹丽等[34]通过瑞氏吉姆萨染色法和电镜观察人工感染后的红螯螯虾时发现，病虾的血细胞总数和透明细胞（AH）数量显著降低（P＜0.01），大颗粒细胞显著增加（P＜0.01），这与Liu等[35]发现红螯螯虾感染白斑综合征72 h后血细胞总数的变化一致。而且，在WSSV的感染下，血细胞的细胞核高度异染色质化，细胞膜发生畸变甚至破损，高尔基体和线粒体结构也受到不同程度的损伤，其他细胞器变性溶解，最终宿主细胞破裂解体。Hameed等[36]认为，除了WSSV在细胞中的快速繁殖直接导致血细胞数量减少外，宿主虾体自身为抵制WSSV的入侵而引发的细胞凋亡也是一个重要原因。细胞核受损意味着遗传基因的转录活性降低，从而影响细胞的正常生长和繁殖，因此血细胞总数下降的速度会越来越快[37]。进一步研究发现，WSSV的基因组无法在感染后的血细胞中复制，其主要的结构蛋白VP26、VP28 和VP51同样无法表达，但可以在感染后的造血组织（HPT）细胞中表达[38]。而且，红螯螯虾HPT细胞受到WSSV入侵后，其细胞骨架系统、信号传导和某些因子都会产生应激反应以此抵制WSSV的感染。

4 免疫预防研究

目前针对红螯螯虾白斑综合征免疫研究主要集中在提高虾体免疫力、选育抗病性新品种、接种疫苗、RNA干扰（RNAi）技术以及中草药活性物质提取等方面。有些学者从阻碍WSSV侵入细胞的机制入手，Huang等[39]发现使用药物减少HPT细胞小窝结构维持的时间后，WSSV进入细胞的数量明显减少；处理重组WSSV蛋白VP28显著降低了红螯螯虾血细胞的凋亡，还可以增强红螯鳌虾的先天性免疫[40]；Chen等[41]和Huang等[42]使用RNAi技术敲除掉CME途径的关键因子（CqCLC、CqAP50和CqDynamin）后，限制住了WSSV通过该途径的入侵。目前增强红螯螯虾免疫力最常用的手段是使用饲料添加剂，能有效激活机体的免疫系统。左迪等[43]在红螯螯虾基础饲料中添加不同含量的维生素C，测定WSSV感染后相关免疫指标。结果表明，VC添加组的相关免疫指标均优于对照组，并且当VC添加量为800 mg/kg时，血细胞和血淋巴的免疫活性顯著提高，对红螯螯虾抵抗WSSV的侵染起到了一定的作用。在此基础上，他们还发现维生素C能够保持感染后血细胞结构的完整性，减少细胞膜受损和细胞裂解[44]。除了维生素C，饲料中添加槲皮素能够显著减低WSSV感染导致的死亡率和感染率，实时荧光定量PCR分析表明，饲料中添加槲皮素还提高了JAK、STAT和ALF等免疫相关基因的表达[45]。香豆素作为一种新型水产饲料添加剂，同样能够减少WSSV拷贝数和减缓感染过程，增强红螯鳌虾的先天免疫，并对WSSV感染具有保护作用[46]。与脊椎动物相比，红螯螯虾作为一种无脊椎动物缺乏特异性免疫系统，它们只能依靠先天性免疫系统来抵御WSSV的侵害，因此传统意义上的疫苗对其并不适用。但Musthaq等[47]研究发现，灭活后的WSSV粒子、WSSV重组蛋白和囊膜蛋白能够起到“疫苗”的作用，为宿主提供免疫作用，有效期一般不超过14 d。

5 展望

随着生活水平日益提高，红螯螯虾越来越频繁出现在餐桌上，未来几年红螯螯虾的养殖产量将继续增加，因此深化研究红螯螯虾白斑综合征的防控十分重要。首先要加强红螯螯虾白斑综合征监测，健全各个地方上的病害预警系统和防控网络，做到科学预防；其次，加大健康养殖技术的推广力度，不断加强对红螯螯虾养殖生产者的规范管理，保持良好的养殖生态环境是抵御WSSV感染的有效手段；最后，应尽快选育出红螯螯虾抗白斑综合征新品种，不断研发出红螯螯虾适用配合饲料，为患病红螯螯虾提供有效的防治方法，从而保障红螯螯虾养殖产业的健康发展。

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Research progress of white spot syndrome of Cherax quadricarinatus

ZHANG Chengshuo1， CHEN Yongcheng1， MA Jingjing1， GUAN Xiaochen2

（1 Jiangsu Coastal Area Institute of Agricultural Sciences， Yancheng 224002;

2 Jiangsu Shengheng Agricultural Technology Co. LTD， Yancheng 224100）

Abstract：This paper reviewed the epidemic situation and research progress of white spot syndrome of Cherax quadricarinatus in China， including the epidemiology， detection technique， pathology and immunoprophylaxis of white spot syndrome.

Key words：Cherax quadricarinatus; white spot syndrome; advance

（收稿日期：2024-04-07）