中国虎纹蛙多碱基重复微卫星位点的多态性

乔芬 邵伟伟 马力 林植华 韦力

摘要  ［目的］筛选出中国虎纹蛙高质量多态性的微卫星标记，用于该物种的鉴定以及遗传多样性、种群结构、遗传连锁图谱分析。［方法］利用新一代测序技术，从中国虎纹蛙部分基因组中筛选出33个三核苷酸重复、42个四核苷酸重复和1个五核苷酸重复微卫星位点，共76个多碱基重复微卫星位点。所有位點对浙江丽水学院两栖爬行动物实验室人工饲养的种群（n=30）进行了扩增和基因型分析。［结果］每个位点观察到的等位基因数和多态信息含量（PIC）的平均值分别为4个（2～7个）和0.514（0.164～0.822），观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.00～0.97和0.18～0.82。有2个位点（THC141和THC377）显著偏离哈迪温伯格平衡，在11个位点中发现了显著的连锁不平衡。［结论］这些新筛选的多态性微卫星标记有助于进一步研究中国虎纹蛙的遗传多样性和开展遗传育种，为制定有效的保护策略和开展分子辅助选择提供依据。

关键词  中国虎纹蛙；多碱基重复微卫星；遗传多样性；分子标记；多态性

中图分类号  S917.4   文献标识码  A   文章编号  0517-6611（2024）07-0082-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.020

Polymorphic Multiple-base Repeat Microsatellite Loci of Chinese Tiger Frog Hoplobatrachus chinensis

QIAO Fen， SHAO Wei-wei， MA Li et al

（College of Ecology， Lishui University， Lishui， Zhejiang 323000）

Abstract  ［Objective］ Screening of highquality polymorphism microsatellite markers in the Chinese tiger frog Hoplobatrachus chinensis can be used for identification， genetic diversity， population structure， and genetic linkage map analysis of this species. ［Method］ In this study， we identified 76 multiplebase repeat microsatellite loci， including 33 trinucleotide， 42 tetranucleotide and 1 pentanucleotide repeat microsatellite loci from partial genome of Chinese tiger frog Hoplobatrachus chinensis using the nextgeneration sequencing technology. We genotyped 30 individuals from a population in an artificial pond at the herpetological laboratory of Lishui University， Zhejiang Province， China. ［Result］ The results showed that the mean number of observed alleles and polymorphic information content （PIC） per locus was 4 （range from 2 to 7） and 0.514 （range from 0.164 to 0.822）， respectively. The observed and expected heterozygosity values ranged from 0.00 to 0.97 and from 0.18 to 0.82， respectively. Two loci （THC141 and THC377） showed significant departure from HardyWeinberg equilibrium and significant linkage disequilibrium was found among 11 pairwise loci. ［Conclusion］ These novel polymorphic microsatellite markers are expected to be valuable for future studies on genetic diversity and conducting genetic breeding， enabling the formulation of effective conservation strategies and the use of molecular assisted selection for H. chinensis.

Key words  Hoplobatrachus chinensis;Multiplebase repeat microsatellite;Genetic diversity;Molecular marker;Polymorphism

中国虎纹蛙（Hoplobatrachus chinensis）之前被称为H.rugulosus，属于无尾目（Anura）蛙科（Ranidae），主要栖息于农田及其附近区域［1］。与其他两栖动物一样，中国虎纹蛙在害虫防治、水生和陆生食物网等方面发挥着重要作用。关于中国虎纹蛙的研究主要包括生长发育［2-3］、声通讯［4］、繁殖特征［5-6］、人工养殖［7］等。作为可食用蛙类，中国虎纹蛙在过去几十年因过度捕捉而造成野生种群资源急剧减少，目前已被列为国家二级保护动物，因此，许多农民在我国南方地区开展了中国虎纹蛙的人工养殖［8］。由于许多养殖场近交现象严重，中国虎纹蛙种质资源多样性严重下降。因此，开展中国虎纹蛙优质人工育种具有重要意义。其中，微卫星标记辅助育种是提高种质资源质量的可行方法之一［9］。迄今为止，虽然已经报道了几十个中国虎纹蛙的微卫星位点［10-11］，但其中大多数位点是二核苷酸重复类型，且不同等位基因之间通常没什么差异，影响种群研究中基因分型的准确性［12］。相比之下，应用多碱基重复微卫星可以提高基因分型的准确性，从而在群体遗传结构和保护遗传学方面具有更高的效 率［12］。为了进一步研究中国虎纹蛙的保护遗传学，笔者筛选并鉴定了76个新的多碱基重复微卫星标记，为进一步研究该物种的遗传多样性和人工育种提供了有力的工具。

1 材料与方法

采用组织提取试剂盒从中国虎纹蛙的肌肉组织中分离得到基因组DNA。利用新一代测序技术，在北京诺禾致源科技股份有限公司进行部分基因组DNA的测序。测序后，利用SSR Hunter软件（Version 1.3）对已组装的序列进行搜索和微卫星位点识别［13］。选定的微卫星序列使用 primer 5.0软件进行引物设计。对于设计的每一对微卫星引物，通过生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成，然后以6个中国虎纹蛙个体的基因组DNA为模板，优化扩增条件。

引物扩增条件优化后，对来自丽水学院两栖爬行动物实验室人工养殖的30个中国虎纹蛙DNA样品进行扩增，扩增产物送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序和分型。采用 M13尾端（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）标记引物进行巢式PCR扩增。所有微卫星的正向引物的5′端都加入了M13的尾端标记，PCR混合物中加入了荧光标记的M13引物［11］。每个PCR扩增体系的总体积为15.0 μL，包含100 ng 模板DNA 1.0 μL，0.5 μmol/L的正向引物1.0 μL，0.5 μmol/L的反向引物1.0 μL，0.5 mmol/L的dNTP、0.1 U 热启动酶（QIAGEN）和1.2 mmol/L 的MgCl2 7.5 μL，不足用灭菌水补足。PCR扩增的条件是：先在95 ℃的初始变性温度下进行5 min，然后进行34次95 ℃的30 s循环，Ta（最佳退火温度）30 s，72 ℃延伸30 s，最后进一步扩增72 ℃ 20 min。PCR产物用ABI 3730测序仪（applied biosystems）进行基因分型，并用Genemarker v1.8软件进行分析。用Genepop 4.0软件［14］对观测杂合度（observed heterozygosity，HO）和期望杂合度（expected heterozygosity，HE）进行计算，用Fstat 2.9.3.2软件［15］对哈迪温伯格（hardy-weinberg equilibrium，HWE）平衡和连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）偏差进行检验。用Cervus 3.0软件计算多态信息含量（polymorphic information content，PIC）［16］。

2 结果与分析

利用新一代测序技术，从部分基因组中获得了450条潜在多碱基重复微卫星DNA序列，共设计并检测了80对微卫星引物。其中4对引物为单带或扩增质量差，其余76对引物（包括33个三核苷酸、42个四核苷酸和1个五核苷酸重复微卫星引物）在30个中国虎纹蛙检测样品中均呈现多态性（表1）。共观察到290个不同的等位基因位点，每个位点平均为4个（范围为2～7个等位基因）。等位基因大小在99（THC353）到300（THC346）之间。

微卫星的多态信息含量（PIC）平均值为0.514，范围在0.164（THC098和THC197）和0.822（THC226）之间。

观测杂合度（HO）范围为0.000～0.967，期望杂合度（HE）范围为0.184～0.822。经过Bonferroni校对后，发现有2个微卫星位点显著偏离哈迪温伯格平衡（HWE）。经过连锁不平衡（linkage disequilibrium）检测试验结果，发现有11对位点间存在连锁不平衡，即位点THC100与THC105之间、THC100与THC250之间、THC100与THC320之间、THC031与THC105之间、THC031与THC320之间、THC063与THC204之间、THC075与THC281之间、THC105与THC320之间、THC106与THC161之间、THC130与THC352之间以及THC312与THC346之间。

3 讨论

微卫星在原核生物和真核生物中普遍存在［17-18］。由于其高重复性、多等位基因性、共显性遗传模式以及在基因组中的广泛覆盖率，微卫星已成为最受欢迎的遗传标记类别之一［19］。传统的微卫星筛选方法包括磁珠富集法、選择性杂交和表达序列标签等，这些筛选方法虽有效但数量有限、耗时长且价格昂贵［20］。近年来，利用计算机软件从DNA序列数据库中对微卫星序列进行筛选，已经迅速取代了从基因组文库中筛选微卫星标记的传统方法［21］。该研究通过新一代测序技术对中国虎纹蛙进行简化测序，从其部分基因组中筛选微卫星序列。结果表明，通过简化测序能够获得足够多的潜在微卫星序列。对设计的80对微卫星引物进行检测，发现有76对呈现出多态性，进一步说明基因组筛选微卫星的有效性。用76对引物对30个检测样品进行扩增和分型，共观察到290个不同的等位基因位点，每个位点平均为4个，等位基因大小在99到300之间。Shao等［10］利用磁珠富集法获得9对中国虎纹蛙微卫星位点，共观察到77个不同的等位基因，平均为8.6个等位基因。Chen等［11］通过转录组测序法获得33对中国虎纹蛙微卫星位点，共观察到174个不同的等位基因，平均为5.3个等位基因。造成这些差异的原因可能与检测样品个体的亲缘关系有关。

该研究中，中国虎纹蛙微卫星的多态信息含量（PIC）平均值为0.514，根据Botstein等［22］描述的PIC值，发现该研究有43个微卫星位点为高信息量位点（PIC>0.5），31个微卫星位点为中等信息量位点（0.5>PIC>0.25），2个微卫星位点为低信息量位点（PIC<0.25），该结果与Chen等［11］对该物种的转录组测序筛选的微卫星结果相似，即PIC为0.552。类似的结果见海陆蛙（Fejervarya cancrivora）［23］的研究报道。但是，与科基蛙（Eleutherodactylus coqui）［24］的PIC（均值为0743）和饰纹姬蛙（Microhyla fissipes）［25］的PIC（均值为0.679）相比，该研究的PIC偏低。

该研究的中国虎纹蛙的平均观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.460和0.582，该两项指标与Chen等［11］对该物种的研究结果相似（HO=0.502，HE=0.609），但均低于Shao等［10］对该物种的研究结果（HO=0.796，HE=0.837），也低于其他无尾两栖类（如沼水蛙［26］和海陆蛙［23］的HO和HE分别为0.488、0.635和0.789、0.669），进一步表明微卫星位点的多态性与检测样品个体的亲缘关系有关。另外，该研究发现，有2个微卫星位点显著偏离哈迪温伯格平衡，相似的研究结果也在海陆蛙［23］和饰纹姬蛙［25］等上发现，这可能是由于2个位点之间的等位基因大小相似引起的［14，27］。

4 结论

该研究筛选的76个多碱基重复微卫星位点丰富了中国虎纹蛙微卫星文库资源，研究结果将有助于开展中国虎纹蛙的遗传多样性、遗传图谱、种群遗传结构和人工育种研究。

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基金項目   浙江省自然科学基金项目（LY19C040001）；丽水市重点研究项目（2021ZDYF09，2020ZDYF07）；百山祖国家公园科学研究项目（2021KFLY01）。

作者简介   乔芬（1983—），女，河北保定人，讲师，博士，从事生态学研究。

通信作者，教授，博士，从事动物学研究。

鸣  谢   该研究工作得到杨宁同学的帮助，在此表示感谢。