山西大豆自然群体遗传多样性的研究

郭数进　杨凯敏　霍瑾　周永航　王宏勇　李贵全

摘 要：为探明由山西不同生态型大豆品种组成的自然群体的遗传多样性，为优异种质资源的筛选和应用提供理论依据，以102个大豆品种组成的自然群体为研究材料，采用59对SSR引物对该群体进行遗传多样性分析。结果表明：59对引物最终筛选出50对多态性好的引物，共检测出157个等位变异，不同位点的等位变异数为2～7个，平均等位变异数为3.14个，其中等位变异数最多的为Satt263，有7个。香农指数变幅为0.097 3～1.668 4，香农指数平均值为0.844 9， 多态性信息量的变幅为0.038～0.761，平均每个引物的多态性信息量为0.431。标记将102个大豆材料在遗传距离GD=0.805处聚为3个群组，群组1有52个材料，群组2由48个材料组成，群组3仅有2个材料。

关键词：大豆；自然群体；分子标记；遗传多样性

中图分类号：S565.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.001

大豆[Glycine max（L.） Merrill]作为一种重要的豆科粮食作物，不仅可以提供优质的蛋白质、油脂和微量营养元素，也在生物燃料的生产中备受关注[1]。大豆的抗性、产量、品质等主要性状大多属于数量性状[2]，受环境影响较大，在育种实践中不易直观把握。近年来，随着分子生物学技术的高速发展，分子标记手段已被越来越多地应用于对不同作物数量性状的研究中[3]。利用分子标记可对作物群体从基因型角度进行研究、分类[4]，降低表型和性状研究带来的局限性[5]，因此已广泛应用于水稻、玉米、大麦等作物[6-8]，在大豆上的应用也日益增加，如Ghosh等[9]选用来自印度不同农业环境地区的32个大豆品种，以SSR分子标记评价其遗传关系，根据遗传多态性和亲缘关系将32个品种分为6类。

本研究以102个在山西选育、种植的不同生态型大豆品种组成的自然群体为研究材料，采用59对SSR引物，筛选多态性良好的标记，用Popgene32软件检测等位基因变异数、香农指数以及遗传距离，对群体进行遗传多样性分析，旨在明确群体遗传丰富程度和多样性，为利用分子标记辅助选择育种、改良大豆数量性状提供理论支持和优良种质资源。

1 材料和方法

1.1 群体来源及组成

选用由山西农业大学大豆育种室选育、提供的102个不同生态型大豆品种为材料。各材料间均无直接亲缘关系，因此为自然群体，于2014年5月11日在山西农业大学播种，10月收获。

1.2 引物来源

从20个大豆连锁群上，每个连锁群选4对SSR标记引物，共80对SSR标记，这些标记参见于Song等发表的大豆遗传图谱，试验引物序列来自Soybase网站（http：//soybase.org/resources/ssr.php），Biomed公司（北京）配制试验所用引物。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取 根据Saghai Maroof[10] 方法用SDS法提取大豆基因组DNA。选取健康、饱满、一致的大豆种子，用1‰高锰酸钾消毒5 min后，晾干，放入9 cm×9 cm培养皿中，置于恒温培养箱中25 ℃条件下催芽，之后转入装有沙土的营养钵中，置于恒温光照培养箱中，25 ℃恒温培养，待豆苗三片真叶展开时进行DNA提取。

1.3.2 DNA浓度测定和质量检测

（1） DNA浓度测定。取30 μLDNA溶液，加1×TE缓冲液至3 mL，使用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm和280 nm处DNA的吸光值（A），用260 nm处吸光值计算DNA的浓度，用A260/A230和A260/A280比值计算DNA纯度。

（2）模板DNA质量检测。①琼脂糖凝胶配置：取1.6 g琼脂糖，加入pH值为8.0的0.5×TBE缓冲液，并定容至200 mL， 配置成0.8%浓度的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热至沸腾，期间用玻璃棒搅拌2～3次，使其充分溶解，待溶液冷却至50～60 ℃，加入一定量EB，使浓度为0.5 μg·mL-1。②凝胶制备：将配置好的溶液倒入制胶板中，使胶面水平，插好梳子，待充分凝结后，放入平板电泳槽中。倒入0.5×TBE缓冲液，以刚好没住凝胶为宜。③上样和电泳：取5 μLDNA样品，与3 μL上样缓冲液混匀后，点入上样孔中。接通电泳，以120 V恒压电泳40～50 min，电泳结束后，用TY4133型凝胶成像分析系统拍照。

根据浓度测定结果将DNA样品分别稀释至SSR工作液浓度：20 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中冰冻保存备用。

1.3.3 PCR扩增体系和扩增程序

（1）PCR扩增体系配置（SSR反应体系）。根据表1配置SSR反应体系，混合均匀，移液枪分装到模板DNA的扩增管中，加入矿物油10 μL。

（2）PCR扩增程序。

分别应用两种PCR扩增仪（ABI2720型和Mastercycler Gradient 型）进行扩增，扩增产物于冰箱中保存（4 ℃）。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶制备和电泳

（1）凝胶制备。称取0.8 g琼脂糖，溶解于100 mL 0.5×TBE电极缓冲液，微波炉加热，期间搅拌2～3次，使其充分溶解，用胶头滴管趁热进行封口操作，封口完成后冷却凝结5 min，再用干净的10 mL注射器，吸取事先配置好的8%凝胶溶液，沿凹形板上方缓缓灌入，灌胶过程中如有气泡产生，应及时进行处理。待凝胶溶液上升至凹形板上端后，停止注胶，轻轻插入40孔梳子，期间应确保梳齿与胶之间（上样槽）没有气泡。待凝胶充分凝结后（一般为1 h左右），缓缓拔去梳子，之后进行点样和电泳操作。

（2）点样和电泳。①点样：取6×上样缓冲液3 μL，置于洁净的一次性PC手套上，排列整齐，从各扩增管中取PCR扩增产物6 μL，与上样缓冲液混合均匀，点入上样槽中，同时点入3 μL 100 bp DNA Marker。②电泳：在进行点样操作之前进行12 W恒功率预电泳15 min，点样完成后，以12 W恒功率电泳1 h左右。

1.3.5 凝胶银染 固定和脱色：电泳结束后，取下凹形玻璃板，蒸馏水清洗胶面3次，用小刀将凝胶缓缓取下，置于固定液中，20 ℃下，在摇床上固定、脱色12 min，弃固定液，蒸馏水清洗3次。

AgNO3渗透：AgNO3渗透液以覆盖凝胶为宜，在摇床上20 ℃下渗透12 min后，蒸馏水清洗3次，每次30 s。

NaOH显色：NaOH（内含甲醛溶液）显色液以覆盖凝胶为宜，摇床上20 ℃下显色，直至条带清晰可见，立即用蒸馏水清洗凝胶2次。取出凝胶，用Bio-RAD凝胶成像系统拍照，分析。

1.3.6 试剂配制 SDS核酸裂解缓冲液（DNA提取液）：称取3.028 g纯Tis，4.653 g EDTA，10.253 g NaCL，5 g SDS，加ddH2O定容至250 mL，调节pH值至8.0，使用前加200 μL β-巯基乙醇。

5 mol·L-1NaCL：称取102.53 g NaCL，加ddH2O定容至250 mL。

1×TE：称取0.121 g纯Tis，0.037 gEDTA，1 mol·L-1HCl调节pH值至8.0，用ddH2O定容至100 mL。

RNase：用水溶解RNase，终浓度10 mg·mL-1，37 ℃水浴30 min，冷却，分装，-20 ℃保存。

5×TBE：称取54 gTis，27.5 g硼酸，3.72 g EDTA，用ddH2O溶解后，调节pH值至8.0，定容至1 000 mL。

0.5×TBE：取5×TBE100 mL，用ddH2O定容至1 000 mL。

上样缓冲液：称取0.8 g蔗糖，0.01 g溴酚蓝，用0.5×TBE定容至1 mL。

10%AP：称取0.2 g过硫酸铵，用ddH2O定容至2 mL（室温下可保存3～5 d）。

0.8%琼脂糖：称取0.8 g琼脂糖，用0.5×TBE定容至100 mL。

8%聚丙烯酰胺非变性胶：40 mL体系，30%聚丙烯酰胺（Acr∶Bis=29∶1）母液21.3 mL，5×TBE（pH值8.0） 8 mL，ddH2O 20.77 mL，10%AP200 μL，TEMEA29 μL。

固定液：1 000 mL体系，10%冰乙酸50 mL，无水乙醇100 mL，用ddH2O定容至1 000 mL。

AgNO3渗透液：1 000 mL体系，称取AgNO32 g，用ddH2O定容至1 000 mL。

NaOH显色液：1 000 mL体系，称取NaOH15 g，用ddH2O溶解，冷却后，加11 mL甲醛溶液，用ddH2O定容至1 000 mL。

1.4 统计分析

试验用的Marker为DNA MarkerⅠ，分离片段为：100，200，300，400，500，600，700 bp，来自北京博迈德科技发展有限公司。为保证准确，每次电泳均点DNA MarkerⅠ，没有扩增出带的品种，进行重复扩增。

分析中各材料在各个标记下的基因型以“A，B，C…a，b，c…”标示。用软件Popgene32检测等位基因变异数、香农指数以及遗传距离。以公式PIC=1-∑pi2算出多态性信息值（PIC），pi表示等位基因i的出现频次。以MEGA4显示并建立材料间等位基因间距树状图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

试验用59对引物对102个群体材料进行扩增和多态性引物筛选，共选出扩增条带清楚、多态性好的引物50对，为总引物数的84.75%。

50对筛选出的SSR引物对102个材料进行PCR扩增，共检测出157个等位变异，不同位点的等位变异数为2～7个，平均每个等位变异数为3.14个，其中等位变异数最多的为Satt263，为7个。

SSR标记位点的香农指数变幅为0.097 3～1.668 4，香农指数平均值为0.844 9，出现9个非多态性标记，其香农指数为0。标记Sat_091的香农指数最大（1.668 4）；标记Satt361的最小（0.097 3）（表3）。

多态性信息量的变幅为0.038～0.761，平均每个引物的多态性信息量是0.431。

标记位点的等位变异数与香农指数（H）呈现极显著正相关（r=0.784）。

2.2 遗传距离及聚类分析

利用软件Popgene32扫描分析50个多态性标记，计算102个材料之间的遗传距离（GD）。遗传距离GD的变幅为0.030 0～1.504 0，平均遗传距离为0.727 8。遗传距离最小的是P40与P41（0.030 0）；其次是P34与P35（0.030 7）；遗传距离最小的是P48与P65（1.504 0）；其次是P46与P66（1.483 2）。根据基因遗传距离进行聚类分析（图2），结果表明，利用标记能将102个大豆材料相互区分，材料在遗传距离GD=0.805处聚为3个群组，群组1有52个材料，占材料总数的50.98%。该群组材料单株产量大致为30 g，为生育期较短的中、高产品种。群组2由48个材料组成，占材料总数的47.06%。群组3仅有2个材料，占材料总数的1.96%，这2个材料的特点为种子具有黑色种皮，而单株产量较小。

3 讨 论

大豆原产我国，因此我国具有优异而丰富的大豆种质资源。然而近年来，我国已由大豆出口国转为大豆进口国，大豆生产量在世界上已排在美国、巴西、阿根廷之后[11]，这与我国大豆单产水平不高、加工品质有待提高以及抗性种质资源稀缺有密切关系。山西地处黄土高原，具有生态类型丰富的大豆资源[12]，而单产水平、品质、抗逆性都有待提高。本试验对由102个大豆材料随机组成的山西大豆自然群体进行了研究遗传多样性分析，研究表明，山西大豆遗传背景相对比较宽广（表3），有利于在引种的基础上进行基因重组及培育优良新品种；通过聚类发现，中等以上产量品种占多数（图2），有一定的产量提升空间，还需要结合黄土高原及黄淮海地区特殊生态条件，采用高产栽培配套技术来提高产量；聚类分析中的第3类材料，产量较低，但属于特殊种质资源，可用作特定加工用途或根据需要配制杂交组合。

现有大豆育种程序中，存在品种遗传多样性低、遗传背景相似程度高的现象，所以，在新品种选育中有意识地选用更为多样性的种质资源，以提供必要的遗传变异能力，有利于品种产生更为广泛的适应性和优异变异[9]。Chowdhury等[13]认为，来自不同国家或距离较远地区的大豆品种具有更高的遗传多样性。遗传背景多样化的亲本，更有可能具有特殊的优良等位变异[14]，因此，在大豆育种中，应尽可能地选用这类亲本，以创造高产、优质的大豆品种。

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