亚致死剂量氰戊菊酯对家蚕生长发育的影响

俞瑞鲜,胡秀卿,柳新菊,汤 涛,吴 珉,吴声敢,赵学平,*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所,浙江 杭州 310021; 2.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江 杭州 310021)

在蚕茧生产季节,由于桑园周边的农药漂移、施药设备农药残留或直接在桑园中进行害虫防治,桑叶极易受到农药污染[1]。近年来,随着现代农业的发展,蚕区周边经济作物的大面积种植,农药的使用频率不断增加,用药种类也不断增多。国内每年因桑园农药使用不当或桑园周围其他农作物使用农药污染导致家蚕中毒的情况时有发生,严重影响蚕农的收入和蚕桑产业的发展[2-6]。如2018年广西因桑园周边柑橘园施用农药导致大面积家蚕发生不同程度的不吐丝不结茧的情况,蚕农损失约1 000万元[7]。因此,有关农药对家蚕的研究也越来越受到重视,农药对家蚕生长发育毒性的研究也逐渐成为了热点。已有研究表明,随着农药的不断摄入,低剂量的药剂虽然不足以导致家蚕急性中毒,但对家蚕的发育历期、眠蚕体重、化蛹率、全茧量、茧层量、茧层率、结茧率等方面均有不同程度的影响,且存在一定的剂量-效应关系[8-11]。

氰戊菊酯(fenvalerate)是拟除虫菊酯类农药的主要品种之一,因其高效、低毒、适用范围广,被广泛用于棉花、果树、蔬菜、大豆、小麦等作物的害虫防治。研究表明,氰戊菊酯对鱼类、蚯蚓等非靶标生物具有发育毒性、免疫毒性、神经毒性、生殖毒性,并能诱导产生氧化应激、细胞凋亡、DNA损伤以及组织病理学的改变[12-18]。近年来氰戊菊酯也被证实是一种潜在的环境污染物和内分泌干扰物,在人体和大部分的环境介质中均可检出[19]。尽管已有研究表明,氰戊菊酯对家蚕具有较高的急性毒性,且持效期较长[20-21],但目前尚未明确其对家蚕生长发育的影响。随着氰戊菊酯在农桑混栽区的广泛施用,可能通过水源、雾滴漂移、喷雾器械等途径污染桑园。其污染浓度通常低于田间实际施用浓度,但随着时间的推移家蚕仍然有可能接触到亚致死浓度的氰戊菊酯。因此,本研究采用浸叶法测定了亚致死剂量氰戊菊酯对家蚕的生长发育影响,以阐明氰戊菊酯对家蚕的亚致死效应,以期为农桑混栽区杀虫剂的合理使用提供科学依据,确保蚕桑产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

家蚕(Bombyxmori),品种为芙蓉、湘辉和皓月,由浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所提供。用常规方法催青并饲养至2龄起蚕供试。桑树品种为农桑12号,采自浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所桑园,未接触农药。

1.2 主要仪器与试剂

仪器:PL203-IC型电子天平[感量0.001 g,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司],MLR-351 H植物培养箱(日本三洋电机株式会社),JWS-A5温湿度表(北京宝力马传感技术有限公司)。

试剂:90%氰戊菊酯原药,杭州庆丰农化有限公司;分析纯丙酮,永华化学股份有限公司;分析纯吐温-80,国药集团化学试剂有限公司。

1.3 急性毒性试验

参照国家标准GB/T 31270.11—2014[22],采用“浸叶法”,选择健康且大小一致的2龄起蚕进行试验。先将氰戊菊酯原药以丙酮为溶剂,配制成一定浓度的母液,冷藏备用。在预试明确有效浓度范围的基础上,将配制好的母液用含0.1%吐温-80的水以等比级差稀释至6个系列梯度浓度。将桑叶于不同浓度的药液中浸渍10 s,取出在通风处悬挂自然晾干,然后将桑叶放入直径15 cm的培养皿内供试。每个浓度重复3次,每重复20头蚕,同时设计空白对照和助剂对照(以最高浓度组所含丙酮量一致的含0.1%吐温-80的水处理)。处理后的家蚕置于温度为24～26 ℃、相对湿度为70%～85%、光周期为16 L∶8 D的人工气候箱内,观察并记录处理24、48、72和96 h后家蚕的中毒症状和死亡数。用镊子轻触虫体不动作为判断死亡的标准。对照组死亡率小于5%的试验为有效试验。

1.4 亚致死效应试验

根据急性毒性试验结果,选择较为敏感的品种皓月用于亚致死效应试验。按照氰戊菊酯96 h-LC50值的1/4、1/12、1/36、1/108、1/324设置5个试验浓度(0.062 8、0.020 9、0.006 98、0.002 33和0.000 775 mg·L-1),采用“浸叶法”,选择健康且大小一致的2龄起蚕进行氰戊菊酯对家蚕的亚致死效应试验。参照1.3节的药液处理方法配制各浓度药液,将桑叶于不同浓度的药液中浸渍10 s,取出在通风处悬挂自然晾干。每个浓度为1个处理,每处理3个重复,每重复15头2龄起蚕,同时设计空白对照和助剂对照(以最高浓度组所含丙酮量一致的含0.1%吐温80的水处理)。处理后的家蚕置于光周期16 h(L)∶8 h(D)、相对湿度70 %～85 %的人工气候箱内微光饲养,直至上蔟结茧。2龄家蚕的饲养温度为26 ℃～28 ℃,随着龄期的增长,每一龄期的温度降低1 ℃。家蚕上簇后移至人工气候室中,温度24 ℃,湿度75%,自然光偏暗均匀。

试验期间,2～3龄蚕每2 d更换一次药液处理的桑叶,4～5龄蚕每天更换有毒桑叶,持续饲喂至家蚕成熟,整个试验饲养至结茧、化蛹为止。每天观察并记录家蚕的异常行为和死亡数,同时记录各龄期家蚕的发育历期和存活眠蚕体重。上蔟开始时统计上蔟的家蚕数,结茧后第8天称取全茧量、茧层量、蛹重,统计良蛹数量,计算茧层率、死笼率和化蛹率;凡茧内的死蚕、死蛹、病蚕、病蛹、半蜕皮蛹(包住胸部或尾部2个以上环节)、不蜕皮蛹、尾部3个环节呈黑色的蛹和虽然健康但未化蛹的毛脚蚕,均记为死笼茧。

1.5 数据统计

用DPS 数据处理系统18.10 高级版计算氰戊菊酯对家蚕72 h和96 h的半致死浓度值(72 h-LC50和96 h-LC50)及其95%置信限,采用Duncan新复极差法对各个生物学指标进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 氰戊菊酯对3个不同品种家蚕的急性毒性

90%氰戊菊酯原药对芙蓉、湘辉和皓月3个不同品种家蚕的急性毒性结果见表1。结果表明:90%氰戊菊酯原药对皓月的急性毒性最高,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分别为0.299(0.257～0.331)mg·L-1和0.251(0.179～0.299)mg·L-1,为剧毒;对湘辉的急性毒性次之,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分别为0.348(0.315～0.411)mg·L-1和0.323(0.299～0.366)mg·L-1,为剧毒;对芙蓉的急性毒性略低,其72 h和96 h的LC50(95%置信区间)分别为0.743(0.687～0.828)mg·L-1和0.570(0.469～0.667)mg·L-1,为高毒。在本次试验条件下,3个品种的家蚕对氰戊菊酯的敏感性依次为皓月>湘晖>芙蓉。

表1 氰戊菊酯对家蚕的急性毒性结果

在试验过程中,不同品种的家蚕经氰戊菊酯处理后均出现了一定程度的中毒症状,如拒食、体扭曲和吐水等。

2.2 亚致死剂量的氰戊菊酯对家蚕的生长发育毒性

2.2.1 对家蚕眠蚕体重的影响

用亚致死剂量的氰戊菊酯药液处理的桑叶饲喂2龄起蚕,各眠期家蚕幼虫的体重变化如图1。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯处理组的2眠蚕体重均略低于空白对照组和助剂对照组,其中0.062 8 mg·L-1氰戊菊酯处理组的2眠蚕体重显著低于空白对照组,但与助剂对照组差异不显著,其余处理组2眠蚕体重与对照组均无显著差异(P<0.05)。而各处理组的3眠和4眠蚕体重与对照组均无显著差异(P<0.05)。

数据间无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。Values with different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).

可见,亚致死剂量的氰戊菊酯对眠蚕体重有一定的影响,随着家蚕龄期的增长,对眠蚕体重的影响也逐渐减弱。

2.2.2 对家蚕发育历期的影响

用亚致死剂量的氰戊菊酯药液处理的桑叶饲喂2龄起蚕,各龄期家蚕发育历期总体呈现先缩短再延长的变化趋势(表2)。各处理组家蚕2龄发育历期均短于对照组,除0.006 98 mg·L-1处理组外,其余处理组家蚕2龄的发育历期均与对照组存在显著差异(P<0.05)。与对照组相比,各处理组家蚕3龄发育历期均有所延长,其中0.000 775 mg·L-1处理组家蚕3龄的发育历期显著长于对照组(P<0.05)。0.000 775 mg·L-1处理组家蚕4龄的发育历期显著短于对照组(P<0.05),其他各处理组家蚕4龄和5龄的发育历期均与对照组无显著差异(P<0.05)。可见,亚致死剂量的氰戊菊酯对家蚕发育历期有一定的影响,其中0.000 775 mg·L-1处理组对家蚕发育历期的影响尤其明显,但随着家蚕龄期的增长,对发育历期的影响也逐渐减弱。

表2 亚致死剂量氰戊菊酯对家蚕幼虫发育历期的影响

2.2.3 对家蚕蛹重的影响

亚致死剂量氰戊菊酯持续饲喂对家蚕蛹重的影响见表3。各处理组蛹重与对照均无显著差异(P<0.05)。

表3 亚致死剂量氰戊菊酯对家蚕经济学性状的影响

2.2.4 对全茧量和茧层量的影响

亚致死剂量氰戊菊酯持续饲喂对家蚕全茧量和茧层量的影响见表3。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯处理组家蚕的全茧量略低于对照组,但与对照均无显著差异(P<0.05)。而0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯处理组家蚕的茧层量显著低于对照组(P<0.05),呈现剂量-效应关系。可见,亚致死剂量的氰戊菊酯对家蚕茧层量有显著影响。

2.2.5 对家蚕幼虫死亡率、结茧率、化蛹率和死笼率的影响

亚致死剂量氰戊菊酯持续饲喂对家蚕幼虫期死亡率、结茧率和化蛹率的影响见表3。亚致死剂量的氰戊菊酯处理后,家蚕幼虫期的死亡率范围为2.22%～6.67%,结茧率范围为93.33%～97.78%,各处理间均无显著差异(P<0.05)。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯处理组家蚕的化蛹率和死笼率与助剂对照无显著差异(P<0.05);0.002 33和0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯处理组家蚕的化蛹率和死笼率与助剂对照组差异显著(P<0.05)。可见,亚致死剂量的氰戊菊酯对家蚕化蛹率和死笼率有显著影响,且0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯处理对化蛹率和死笼率的影响尤为明显,蛹体发黑、变形、长霉(图2)。

A, 发黑;B和C,变形;D,长霉。A, Black; B and C, Out of shape; D, Mouldy.

3 讨论

目前对于亚致死剂量并没有统一的界定,其取值也因研究对象和研究目的不同而有所差异,大多数选择的剂量范围为LC10～LC30[23-25]。本研究中的氰戊菊酯通过外源污染到达桑叶上的剂量要远低于施用浓度,故选择对家蚕的存活影响较小,但可能影响家蚕正常的生长发育的试验剂量(0.000 775～0.062 8 mg·L-1)作为本研究的亚致死剂量。

农药对家蚕的生长发育毒性效应通常包括对家蚕幼虫眠蚕体重、发育历期、化蛹率、蛹重、结茧率、全茧量、茧层量、茧层率等敏感指标的影响[26],并且不同药剂对家蚕生物学指标的影响因药剂的不同而有所不一致,且受影响的程度也不同。已有研究表明,在家蚕2～3龄阶段暴露于0.16 mg·L-1三唑磷后,幼虫死亡率为0,但全茧量、茧层量和茧层率显著降低[27];亚致死剂量的吡虫啉对家蚕的生长发育和产茧量都有较大影响[28];亚致死剂量的溴虫腈对家蚕的发育历期、蛹重和茧层量无不良影响,其中全茧量反而有所增加[28];在2～3龄阶段暴露于0.40 mg·L-1戊唑醇后,全茧量、茧层量和茧层率分别显著降低6.8%、11.8%和4.4%[8];亚致死剂量的甲氧虫酰肼对家蚕眠蚕体重、全茧量、茧层量、茧层率和结茧率等指标均具有显著影响[29]。本研究结果表明,亚致死剂量的氰戊菊酯处理对眠蚕体重和发育历期有一定的影响,但随着家蚕龄期的增长其影响逐渐减弱;对家蚕化蛹率和死笼率有显著影响(P<0.05);0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯处理组对家蚕茧层量有显著影响(P<0.05)。可见,亚致死剂量的氰戊菊酯处理对家蚕的生长发育造成了明显的影响。茧层量是家蚕重要的生长发育指标和经济性状,也是家蚕吐丝功能的表现。有研究报道,不同农药处理导致家蚕结茧率显著降低,对家蚕丝腺进行组织病理学观察发现家蚕丝腺显著受损,丝腺体膜受损、管腔空泡化,进而影响家蚕吐丝[8,30]。本研究中亚致死剂量的氰戊菊酯处理对家蚕茧层量的影响是否与丝腺组织的受损有关还有待进一步研究。

本研究中,0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯处理组对家蚕3龄和4龄发育历期有显著影响(P<0.05),0.002 33、0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯处理组对家蚕化蛹率和死笼率有显著影响(P<0.05),呈现非单调剂量-效应关系,可能与氰戊菊酯的内分泌干扰作用有关。越来越多的研究表明一些内分泌干扰物的活性被证明具有复杂的非单调剂量-效应关系,而不是单调的剂量-效应关系[31-32],如滴滴伊在10-12～10-8mol·L-1的剂量范围内,诱导垂体瘤细胞分泌催乳素的效应呈倒U型曲线,硫丹、咪酰胺也表现出相似的剂量-效应曲线[33-34]。阿特拉津津对两栖动物变态的影响也被证明是非单调剂量-效应关系[35],75 μg·L-1的阿特拉津处理能抑制虎皮蝾螈变态,而250 μg·L-1时却促进变态[36],在1 mg·L-1时促进南美蟾蜍变态,而5 mg·L-1时抑制变态,其他剂量时效应不明显[37]。高剂量(25 μg·kg-1·d-1)和低剂量(25 ng·kg-1·d-1)的双酚A 降低雌鼠的生殖能力,而中间剂量(250 ng·kg-1·d-1)对雌鼠的生殖能力没有明显影响[38]。双酚A经消化道途径给药后,低剂量组小鼠子宫腔面积增大,子宫上皮增生明显,但随着双酚A剂量的逐步增大,其子宫上皮增生作用反而逐渐减弱[39]。随着内分泌干扰物非单调剂量-效应研究的不断深入,学者们开始从细胞毒性、细胞和组织特异性的受体和共因子、受体选择性、受体下调和脱敏、受体竞争、内分泌负反馈等机制上对非单调剂量-效应进行了解释[40-41]。而本研究中获得的氰戊菊酯对家蚕发育历期、化蛹率和死笼率的非单调剂量-效应结果,其作用机制目前尚不清楚,有待进一步深入探索。另外,本研究中获得的非单调剂量-效应未能呈现完整的非单调剂量-效应关系,可能与本研究选择的剂量范围有关,未能完全覆盖整个剂量效应关系。有观点认为即使很低剂量的内分泌干扰物也能对生物的内分泌系统产生干扰作用,所以内分泌干扰物像致癌物一样不存在安全阈值[42-43]。因此,今后针对此类内分泌干扰物研究设计时,应该充分考虑剂量范围,便于精准掌握重点评价指标。

此外,氰戊菊酯对家蚕的急性毒性为高毒或剧毒,在生产中通常不会在桑园内使用,但往往容易忽略其在农桑混栽区的使用。根据本研究结果,亚致死剂量的氰戊菊酯对家蚕眠蚕体重、发育历期、茧层量、化蛹率、死笼率等指标均有不同程度的影响。因此,在农桑混栽区使用氰戊菊酯时应与桑园保持足够的距离,避免雾滴漂移或其他农事活动污染桑园引起家蚕中毒。