木质素基苯醚甲环唑纳米颗粒构建及防控杨梅凋萎病研究

张 启, 张家栋, 方 云, 熊秋雨, 王 嵘,程敬丽, 孙 鹂, 赵金浩*,

(1.浙江大学 农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室，浙江省作物病虫生物学重点实验室，杭州 310058；2.浙江省兰溪市经济特产技术推广中心，浙江 兰溪 321100；3.浙江省农业科学院，杭州 310021)

杨梅凋萎病于2004 年首次在浙江发现[1]，目前已成为南方杨梅树生长的主要病害。染病初期，杨梅树嫩梢部分枯萎，随着病情加重，小枝枯死会发展为大枝枯死，进而引起主干枯死[2-3]，造成巨大的经济损失。

目前，杨梅凋萎病主要以化学农药防治为主[4]。市场上的农药主要是悬浮剂和可湿性粉剂等传统制剂，存在农药助剂用量高、农药液滴粒径大和容易漂移流失的弊端[5]，易导致环境污染、药效期缩短和利用率降低等问题[6]。此外，农药施用后易受到各种因素的影响，比如叶片弹跳滚落、地表径流和农药降解等[7]，部分药液无法到达靶标部位，导致农药利用率偏低和农药环境富集等问题[8]。而与纳米技术相结合的纳米农药为解决该问题提供了新的研究思路。纳米农药具有粒径小、比表面积和分散性高等特点，可以提高农药的持效期和叶面亲和性[9]，并有望通过减少农药助剂的使用来最大限度地降低环境风险。

现已有多种以木质素类材料为纳米载体制备纳米农药的报道[10]。木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，其化学结构可能因木质素来源而异[11]。近年来，木质素磺酸盐及其改性衍生物因具有成本低、生物降解性好、紫外吸收能力强等优点，受到纳米农药领域的关注。但由于木质素磺酸盐的强水溶性，限制了其在纳米农药诸多制备方法中的使用，比如界面聚合法、溶剂挥发法、溶剂交换法等，对木质素磺酸盐进行改性，提高其脂溶性，拓宽其使用范围，成为研究的热点[12]。苯醚甲环唑 (difenoconazole) 是一种广谱性杀菌剂，对多种病害有良好的防效，尤其对引起杨梅凋萎病的病原真菌有良好的防控作用[13]。本研究以苯醚甲环唑为供试药剂，用苯甲酸酐对木质素磺酸钠进行疏水性改性后负载苯醚甲环唑，制备了木质素基苯醚甲环唑纳米颗粒，对其结构进行了表征，并进一步评估了该制剂的稳定性、药效持留期及其对杨梅凋萎病的防控效果。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

苯甲酸酐和木质素磺酸钠 (分析纯，上海笛柏生物科技有限公司)；十二烷基硫酸钠 (纯度93%，山东优索化工科技有限公司，SDS)；氯化钠、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷 (DCM)、三乙胺 (TEA)、异丙醇、无水硫酸镁和乙腈 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (分析纯，月旭科技 (上海) 股份有限公司，简称PSA)；氯化锂和十八烷基硅烷键合硅胶 (分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司)。10%苯醚甲环唑微乳剂 (河北威远生物化工有限公司，简称Di ME)；十六烷基三甲基溴化铵 (分析纯，上海展云化工有限公司，简称CTAB)；苯乙基酚聚氧乙烯醚 (分析纯，江苏省海安石油化工厂，简称农乳602)；93%十二烷基硫酸钠 (简称SDS) 和辛基苯酚聚氧乙烯醚 (简称OP-10) (山东优索化工科技有限公司)；椰油酰胺丙基甜菜碱 (分析纯，上海源叶生物科技有限公司，简称CAB)；苯醚甲环唑原药 (difenoconazole，纯度96%，武汉远城科技发展有限公司，简称Di Tech)。

杨梅凋萎病的致病菌，由浙江大学农业与生物技术学院生物所从杨梅凋萎病的病枝上进行病菌分离和纯化，并提取病菌的DNA 进行PCR 扩增，在GenBank 中进行同源性分析比较，确定致病菌种属。

LGJ-10 真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技有限公司)；LC-20A 高效液相色谱仪 (日本岛津株式会社)；Zetasizer Nano ZS-90 马尔文激光粒度仪(英国马尔文公司)；G300 扫描电子显微镜 (德国卡尔蔡司公司)；Nicolet Ava-tar370傅里叶变换红外光谱仪 (美国赛默飞世尔科技公司)；BS210S 电子天平 (德国赛多利斯公司)；TG-16 高速离心机 (四川蜀科仪器有限公司)；Turbiscan Lab 稳定性分析仪 (法国Formulation 仪器公司)；RXZ-310C 恒温光照培养箱 (宁波江南仪器制造厂)；GC-2010 Plus 气相色谱-质谱联用仪 (日本岛津公司)。

1.2 木质素磺酸盐纳米农药颗粒的制备

1.2.1 苯甲酸酯化的木质素磺酸钠 (BLS) 的制备参考文献方法[14]进行。将1 g 木质素磺酸钠在90 ℃下搅拌溶解于15 mL 质量浓度为10% 的LiCl/DMF 溶液中，降至室温后，通入氮气保护。将5 g 苯甲酸酐溶解在DMF 中，加入室温搅拌下的木质素磺酸钠DMF 溶液，再加入0.022 mol 三乙胺，60 ℃下搅拌过夜。将反应液以8000 r/min的速率搅拌5 min，取约15 mL 上清液加入300 mL异丙醇，于8000 r/min 下离心5 min，得到产物沉淀，用异丙醇清洗3 次。将沉淀移入40 ℃的真空干燥箱内干燥，得到苯甲酸酯化的BLS 样品。

1.2.2 苯醚甲环唑纳米颗粒 (Di@BLS) 的制备 称取10 mg SDS 溶于5 mL 水中，得到质量浓度为0.2%的SDS 水溶液，作为水相。将10 mg Di 和50 mg BLS 溶于500 mg 的DCM 中 (即BLS 载体的质量浓度为1%，药料比为1 : 5)，作为油相。在1000 r/min 的搅拌下，将油相滴入水相，使用高剪切乳化机以10000 r/min 对油水混合物剪切1 min，进行预乳化。将剪切后的溶液放入细胞破碎仪，在70%的功率下超声2 min (超声1 s，暂停2 s)，使两相充分混合乳化。将乳液以500 r/min 的转速搅拌2 h，使溶液内部的DCM 挥发后，得到Di@BLS。

1.3 木质素磺酸盐纳米颗粒的配方优化

1.3.1 BLS 载体浓度配方筛选 以溶液粒径大小为参照，对制得BLS 的最佳浓度进行了筛选，将15～75 mg 的BLS 载体分别溶于500 mg DCM 中，后续不同BLS 浓度的Di@BLS 的制备步骤参照

1.2.2 节，使用马尔文激光粒度测定仪检测不同溶液的粒径大小变化。

1.3.2 BLS 载体与Di 料药比筛选 将BLS 载体与10 mg Di 分别按照质量比为1 : 1、3 : 2、2 : 1、3 : 1、5 : 1 和7 : 1 溶于500 mg DCM 中，后续Di@BLS 的配制步骤参照1.2.2 节，使用制剂稳定分析仪和马尔文激光粒度仪检测不同料药比Di@BLS 的TSI 指数和粒径变化。

1.3.3 表面活性剂种类筛选 分别对阳离子、阴离子、两性和非离子型表面活性剂进行了筛选。将50 mg BLS 载体与10 mg Di 加入5 mL 含有质量浓度为0.2%表面活性剂的水溶液中，后续步骤参考1.2.2 节，检测不添加表面活性剂的Di@BLS的Zeta 电位以及添加不同表面活性剂后的Di@BLS粒径大小。

1.3.4 表面活性剂用量筛选 将50 mg BLS 载体与10 mg Di 加入5 mL 含优化筛选的表面活性剂水溶液中，表面活性剂水溶液的质量浓度设置为0.1%、0.3%、0.8%、1%、1.3% 和1.5%，后续Di@BLS 的配制步骤参考1.2.2 节，使用马尔文激光粒度测定仪检测不同表面活性剂含量的Di@BLS粒径大小，确定表面活性剂使用的最佳浓度。

1.4 BLS 和Di@BLS 的表征

1.4.1 BLS 的核磁共振氢谱(1H NMR) 将10 mg干燥样品溶于0.5 mL 氘代DMSO，对样品进行1H NMR 分析。

1.4.2 Di@BLS 的红外光谱分析 (FT-IR) 通过FT-IR 对Di 原药、BLS 和Di@BLS 等样品化学官能团的变化进行检测。取适量干燥的样品粉末与KBr 粉末混合后，研磨3～5 min 进行压片，在4000～500 cm-1的波数范围进行红外检测。

1.4.3 Di@BLS 的形貌表征和粒径分析 通过扫描电子显微镜 (SEM) 观察Di@BLS 的形貌特征。取适量干燥的Di@BLS 样品粉末固定在导电胶上，设定加速电压为3.00 kV，工作距离为5.5 mm，观察其形态特征。并在视野内选择200 个纳米颗粒检测平均粒径，同时使用马尔文激光粒度测定仪检测Di@BLS 的粒径分布。

1.5 杨梅凋萎病致病菌分离鉴定

由浙江大学农业与生物技术学院生物所进行。从浙江省兰溪市马涧镇采集杨梅凋萎病病枝，采用科赫氏法则对其致病菌进行分离鉴定。对所分离的致病菌进行培养后再接种到杨梅树苗上。杨梅苗为网上购买，为降低杨梅在运送时的蒸腾作用，对杨梅叶片进行了切割：将致病菌菌饼接种于杨梅叶痕处[15]，以接种空白菌饼的杨梅叶作为对照。对杨梅套袋保湿，观察记录发病情况，确定是否与田间病害症状一致。之后从发病部位再分离病原菌进行鉴定，观察是否与原致病菌一致。

1.6 离体抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法[16]分别测定Di@BLS、Di ME 和Di 对杨梅凋萎病致病菌的抑制活性，计算有效中浓度 (EC50)。配制PDA 培养基，加热融化后混入供试药剂，质量浓度分别设置为0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL，以不含药剂的PDA 培养基作为空白对照。将致病菌接种于PDA 培养基上，统计菌落生长情况，每个试验重复3 次。

1.7 Di 在杨梅体内的吸收转运试验

1.7.1 标准曲线的测定 称取10.0 mg Di，用乙腈溶解并定容至10 mL，再用乙腈稀释至质量浓度分别为0.05、0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12、15、30、60 和120 μg/mL 的系列标准溶液，用高效液相色谱 (HPLC) 检测标准溶液的出峰面积。以标准溶液的峰面积为纵坐标 (y)，Di 质量浓度为横坐标 (x)，绘制标准曲线。HPLC 条件：流动相为V(甲醇) :V(水) = 30 : 70，检测波长为254 nm，流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样量 20 μL。

1.7.2 添加回收试验 使用QuEChERS 方法[17]提取杨梅叶片中的苯醚甲环唑。称取0.5 g 杨梅叶片，加入含Di 质量分别为1、5、10、50 μg 的Di 乙腈标准溶液。将叶片烘干后放入研钵内，加入液氮捣碎。将碎叶放入50 mL 离心管中，加入0.5 g 无水硫酸镁、0.35 g 氯化钠和10 mL 乙腈，超声20 min，于8000 r/min 下离心5 min。取5 mL上清液，旋转蒸发至近干，加入1 mL 乙腈重新溶解；加入30 mg 硅镁型吸附剂、100 mg 无水硫酸镁、15 mg C18和30 mg PSA。用0.22 μm 滤膜过滤，HPLC 法检测其叶片内部Di 的质量浓度，计算其含量，并与原添加药剂量进行比对，计算添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。每个浓度重复5 次试验。

1.7.3 Di 在杨梅苗上的持效期试验 取多株长势相近的一年生杨梅苗，在中间的叶片上分别滴加0.5 mL 0.2%的Di@BLS 与Di ME，自然晾干后，分别于1、4、7、10、14 d 后检测杨梅苗上叶与下叶的药剂含量变化，确定两种药液的持效期。叶片中药剂的提取步骤参考1.7.2 节中QuEChERS方法，并使用HPLC 检测药剂浓度。

1.7.4 Di 的田间持效期试验 将40 mL 质量浓度为200 mg/L 的Di@BLS 装入50 mL 注干瓶中，于田间对杨梅苗进行树干注射，检测药液持留情况，试验地点选在浙江省兰溪市马涧镇家庭农场。使用电钻在杨梅树基干距地面10 cm 处斜向下钻孔，插入注干瓶，并在注干瓶后插洞，维持内外大气压平衡，30 d 后取样检测杨梅叶片内的药剂存留情况。叶片中药剂的提取步骤参考

1.7.2 中QuEChERS 方法，并略作改进：取5 g 树叶加入液氮磨碎后，转入50 mL 离心管内，加入20 mL 乙腈、0.5 g 氯化钠和2 g 无水硫酸镁，超声20 min 后，于8000 r/min 下离心5 min。取上清液10 mL，旋转蒸发后加入1 mL 丙酮重新溶解，加入50 mg PSA、50 mg 硅镁型吸附剂、150 mg无水硫酸镁和25 mg C18，超声1 min 后，采用0.22 μm 有机滤膜过滤，使用气相色谱-质谱联用仪 (GC-MS) 检测样品。

GC-MS 条件：进样温度250 ℃，程序升温：120 ℃保持1 min，以30 ℃/min 的速度升至130 ℃，5 ℃/min 升温至250 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持5 min，色谱柱为HP-5MS 石英毛细管柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent)，电离方式EI；质量扫描范围m/z30～500；接口温度280 ℃；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃。

1.8 盆栽试验

以东魁杨梅为供试品种，测试Di@BLS 对杨梅凋萎病的防治效果。在1 年树龄的杨梅苗上喷洒20 mL 有效成分含量 200 μg/mL 的Di@BLS，杨梅苗在室温下自然晾干后，立即接种杨梅凋萎病病菌，以喷施清水的杨梅苗作为空白对照，喷施同等药剂浓度的Di ME 作为阳性对照。施药后，叶片应呈全部润湿的状态。接种杨梅凋萎病菌后培养30 d，按公式 (1) 计算发病率。每处理3 次重复。

其中：E为发病率，%；Dt为发病掉落叶片数，Dc为总叶片数。

2 结果与讨论

2.1 BLS 和Di@BLS 结构表征

2.1.1 BLS 的1H NMR 如图1 所示，与木质素磺酸钠 (LS) 相比，BLS 的1H NMR 在化学位移δ7.2～8.2 处出现新的吸收峰，这是由于苯环上的H 电子云密度较小，屏蔽效应较弱，苯甲酸酐在取代LS 上的羟基后，LS 在低场出现新的吸收峰，表明苯甲酸酐成功对木质素磺酸盐进行了酯化。

图1 BLS 和LS 的 1H NMR 谱图Fig.1 1H NMR spectra of BLS and LS

2.1.2 Di@BLS 的红外谱图 测试结果如图2 所示。在Di@BLS 的红外谱图中，1682 cm-1处的吸收峰为Di 上特有的C＝N 伸缩振动峰，750 cm-1处的特征峰为Di 上C－Cl 的伸缩振动峰[18]，通过对比Di 与Di@BLS 的谱图可以发现两者的特征峰位置基本一致，证明本研究成功合成了负载Di 的Di@BLS 纳米农药颗粒。

图2 LS、BLS、Di 及Di@BLS 的FT-IR 谱图Fig.2 FT-IR spectra of LS, BLS, Di and Di@BLS

2.1.3 Di@BLS 的粒径与形貌表征 图3 (a) 为Di@BLS 纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。可见Di@BLS 纳米颗粒的球体形状规则，颗粒的表面光滑，大小分布比较均匀，粒径在86.82 nm 左右；图3 (b) 为使用马尔文激光粒度仪检测得到的Di@BLS 粒径分布图，Di@BLS 的平均粒径大小在135.2 nm，马尔文激光粒度仪检测的粒径较扫描电子显微镜统计大的原因与马尔文检测粒径为纳米颗粒的水合粒径 (流体动力学粒径) 有关[19]。

图3 Di@BLS 的扫描电镜图 (a) 以及Di@BLS 的粒径分布图 (b)Fig.3 SEM (a) and particle size distribution of Di@BLS (b)

2.2 木质素磺酸盐纳米颗粒的配方优化

2.2.1 BLS 载体浓度配方优化 图4 为BLS 浓度对Di@BLS 纳米颗粒粒径的影响。通过调节BLS的浓度可以发现，随着BLS 浓度的提高，纳米颗粒的粒径不断增大；在BLS 质量浓度从1.3%提升至1.5%后，所得纳米颗粒的粒径大幅上涨。造成这一现象的原因可能是高浓度的BLS 油相进入水中时，分子间距离较小，易聚集形成大粒径的纳米颗粒。后续试验为获得粒径较小的Di@BLS 纳米颗粒，选用质量浓度为0.2%的BLS 配制农药纳米颗粒。

图4 BLS 浓度对Di@BLS 纳米颗粒粒径的影响Fig.4 The effect of BLS concentration on the particle size of Di@BLS nanoparticles

2.2.2 BLS 和Di 的料药比配方优化 图5 (a) 为Di@BLS 的料药比对粒径的影响。从中可以发现，随着料药比的增加，Di@BLS 的颗粒粒径呈现先减小后增大的趋势，在料药比为5 : 1 时，粒径最小；图5 (b) 为料药比对Di@BLS 的TSI 指数的影响。TSI 指数越小，说明样品的稳定性越高，在料药比为1 : 1 时制得的Di@BLS 样品TSI 指数较高，表明样品稳定性低，这可能是因为投入的载体较少，样品中存在大量未被包覆的药剂悬浮。而TSI 指数最小、稳定性最高的料药比为5 : 1，之后，随着料药比进一步增加，TSI 指数升高，这可能与料药比增加导致颗粒粒径增大，颗粒之间的静电斥力减小有关。综上，最佳料药比为5 : 1。

图5 料药比对纳米农药粒径的影响 (a) 以及稳定性指数(TSI) 的影响 (b)Fig.5 The influence of material-to-pesticide ratio on the particle size of nanopesticides (a) and the influence of Instability Index (TSI) (b)

2.2.3 Di@BLS 的表面活性剂种类筛选 图6 为表面活性剂种类对Di@BLS 样品粒径大小的影响。从中可以发现，使用表面活性剂CTAB 制备的Di@BLS 粒径最大，接近800 nm，而使用SDS制备的Di@BLS 粒径最小，这可能是因为SDS 是阴离子型表面活性剂，而Di@BLS 内部含有较强的负电荷，SDS 的引入带去了更多负电荷，增大了Di@BLS 颗粒间的斥力，使颗粒形成时不容易聚集，粒径减小；而CTAB 是阳离子型表面活性剂，会引入大量正电荷，使Di@BLS 颗粒之间的静电斥力减弱，更容易发生聚集沉淀，因而增大纳米颗粒的粒径。故选用SDS 作为表面活性剂。

图6 表面活性剂种类对纳米农药粒径的影响Fig.6 The effect of surfactant types on the particle size of nanopesticides

2.2.4 Di@BLS 中表面活性剂用量的筛选 图7 为SDS 浓度对Di@BLS 粒径的影响。可见，随着SDS 浓度提高，Di@BLS 粒径逐渐增大，这可能是因为表面活性剂浓度增大，导致溶液的黏度增高，使纳米颗粒在形成过程中不易分散，从而形成了粒径较大的Di@BLS 纳米颗粒。当SDS 质量浓度为0.1%～0.4%时，颗粒粒径较小；而当SDS 质量浓度在0.8%以上时，颗粒粒径在200 nm 以上，所以后续试验使用的SDS 质量浓度维持在0.1%～0.4%。

图7 SDS 浓度对纳米农药粒径的影响Fig.7 The effect of SDS concentration on the particle size of nanopesticides

综上，本研究最佳制剂配方选择在BLS 载体浓度为1%、料药比为5 : 1、质量浓度为0.2%的SDS 用量条件下配制Di@BLS。

2.3 致病菌的鉴定

从浙江省兰溪市马涧镇采收集的杨梅树病枝分离出4 种病菌，随后将分离出的病菌分别回接到杨梅植株上，发现菌株Z2-2 可引起杨梅苗发生杨梅凋萎病 (表1)。图8 为接种病菌Z2-2 的杨梅苗发生杨梅凋萎病的相关症状，可以看出：接种Z2-2 的杨梅苗发病时，首先于接种病菌菌饼的叶痕处变黑，之后顶芽枯萎，从顶端叶片开始向下叶片出现枯萎症状；之后从接种发病的杨梅病株上重新分离病菌，经鉴定为可可毛色二孢菌Lasiodiplodia，因此最终确定病菌Z2-2 为致病菌。

表1 兰溪市马涧镇下杜村的杨梅病菌分离鉴定情况Table 1 Isolation and identification of diseased bayberry branches from Xiadu Village, Majian Town, Lanxi City

图8 Lasiodiplodia 在杨梅苗上的接种效果Fig.8 Lasiodiplodia inoculation effect on bayberry seedlings

2.4 离体抑菌活性

图9 为不同浓度下Di Tech、Di ME 与Di@BLS在培养基中对Lasiodiplodia的离体抑制效果。3 种药剂对Lasiodiplodia的EC50值分别为0.395、0.484和0.643 μg/mL (表2)，其中Di@BLS 的抑菌效果稍弱于Di ME 与Di。这可能是由于Di 从Di@BLS中释放需要一定时间，因此Di@BLS 处理组中游离的Di 浓度低于Di ME 与Di Tech 处理组中的浓度。

表2 Di Tech、Di ME 和Di@BLS 对Lasiodiplodia 的抑菌活性Table 2 The antimicrobial activities of Di Tech, Di ME and Di@BLS against Lasiodiplodia

图9 不同质量浓度下Di Tech、Di@BLS 与Di ME 对Lasiodiplodia 的抑制作用Fig.9 Inhibition of Di Tech, Di@BLS and Di ME on Lasiodiplodia at different concentrations

2.5 Di 在杨梅体内的吸收转运

2.5.1 标准曲线及添加回收试验结果 测定结果表明，Di 在0.05～120 μg/mL 浓度范围内相关性良好，回归方程为y=11641.6x+ 5122.3，决定系数R2= 0.999，表明仪器方法准确性良好，可用于定量分析。添加回收试验结果(表3)表明，当Di 的添加水平在0.5～25 μg/mL 时，Di 的平均回收率为95%～97%，相对标准偏差为5.2%～9.9%，表明本研究建立的样品前处理方法对Di 的回收率符合国家标准，可以用于后续对叶片中Di 提取试验。

表3 苯醚甲环唑在杨梅叶片中的添加回收率Table 3 Recovery rate of difenoconazole in bayberry leaves

2.5.2 Di 在杨梅苗上的持效性 图10 显示了14 d 内Di 在杨梅苗体内的吸收转运趋势以及各部位持留情况。对比发现，Di ME 与Di@BLS 均能被杨梅苗叶部吸收，但其在体内的各部位含量变化差异较大。

图10 Di@BLS 与Di ME 在杨梅苗上叶与下叶中含量的变化Fig.10 Changes of Di@BLS and Di ME contents in the upper and lower leaves of bayberry seedlings

对于向上运输，处理1 d 后Di ME 处理组在杨梅上叶的含量为34.89 mg/kg ± 1.29 mg/kg，较高于Di@BLS 含量 (7.03 mg/kg ± 0.97 mg/kg)，这与已知的苯醚甲环唑作为一种内吸性杀菌剂能通过木质部向上传导的性质保持一致，而将Di 进行纳米包封后可能对其在杨梅体内的运输方式上有所影响从而造成了短时间内的运输差异。但随着试验时间的延长，Di@BLS 处理组的杨梅叶片中Di 含量较为稳定，并且在14 d 时Di 含量仍有所增加，为10.15 mg/kg ± 1.21 mg/kg，高于Di ME处理组的含量 (5.85 mg/kg ± 1.28 mg/kg)，而Di ME在前7 d 内含量快速下降后趋于平稳，这说明Di@BLS 具有良好的缓释性能，使其保护药剂不被快速降解，从而在杨梅植株体内具有更长的药剂持效时间。

对于向下运输，Di ME 在14 d 内呈现出了先增后减再增再减的趋势，而Di@BLS 则是先增后减然后稳定增加的趋势。两者在前两种趋势上保持一致，这可能是由于下叶一边接收来自处理叶的药剂，一边向下继续运输药剂，在第4 天时两者速度达到平衡，从而出现最多积累量。处理10 d后Di ME 含量快速下降，这可能是积累的药剂降解所致；而Di@BLS 含量则是持续增长，证明了Di@BLS 能有效向下运输Di 并且延缓其降解速度，提高药剂持续期。综上可知，Di@BLS 能通过杨梅苗叶部吸收至体内，并且拥有上下双向运输性能。此外，Di@BLS 的缓释性能延缓了药剂的降解，使具有更长的持留时间。

2.6 Di 的田间持效性

图11 为Di@BLS 树干注射30 d 后的GC-MS谱图。可以看出，Di@BLS 中的Di 在30.3 min 时出峰，与Di 标准样品的出峰时间相同。同时可以观察到，在叶片与Di 标准样品中，出现了同样的SIM 离子碎片265 与323[20]，这是Di 的SIM 离子数值。证明杨梅树中仍有Di@BLS 持留，而Di ME 样品中没有检测出Di 存在。

图11 苯醚甲环唑标样 (a) 与杨梅叶片 (b) 的质谱图；标样 (c) 与叶片中苯醚甲环唑出峰位置 (d) 对应的SIM 离子图Fig.11 The mass spectra of the standard sample(a) and bayberry leaves (b); SIM ion map corresponding to the peak position of difenoconazole standard sample (c) and the leaf (d).

2.7 盆栽试验结果

图12 为Di@BLS 和Di ME 对杨梅凋萎病的盆栽试验防治效果。可以看出，与清水对照相比，喷施Di@BLS 和Di ME 均降低了杨梅凋萎病的发病率，其中Di ME 处理组的发病率为27.3%，Di@BLS处理组的发病率为25.0%，与Di ME 的接近，说明Di@BLS 对杨梅凋萎病具有较好的防治效果。

图12 Di@BLS 和Di ME 在200 μg/mL 下对杨梅凋萎病的盆栽试验防治效果Fig.12 Potted control effect of Di@BLS and Di ME on wilting disease of bayberry at 200 μg/mL

3 结论

本研究基于苯甲酸酐疏水化改性木质素磺酸盐制备纳米农药，从纳米载体浓度、料药比、表面活性剂种类及用量等多方面进行配方优化，制备了负载苯醚甲环唑的木质素基纳米农药 (Di@BLS)，其外观形貌呈现为球形颗粒，平均粒径为135.2 nm。Di@BLS 的制备采用“溶剂挥发法”，苯醚甲环唑进入改性木质素磺酸钠纳米颗粒内部，并受到载体保护，在减少助剂用量得到纳米制剂的同时，提升了苯醚甲环唑的持留效果。Di@BLS 具有良好的缓释性能，相比于商品化的苯醚甲环唑微乳剂，其可以帮助苯醚甲环唑在杨梅体内存留更长时间，对杨梅提供更长久的保护。目前本研究仅处于探索发展阶段，后续可通过控制粒径、药剂混配和提高叶面黏附性等进一步提高Di@BLS的性能，使此类木质素纳米材料作为有效的缓释纳米载体更好地应用于作物病虫害防控，该研究成果对于后续开发及构建缓释农药新制剂具有重要参考价值。