植物病原菌对解偶联剂的抗性机制研究进展

程星凯, 张俊婷, 刘鹏飞, 刘西莉

(中国农业大学 植物保护学院，北京 100193)

植物病害一直是限制农业健康稳定发展的重要因素，在现阶段农业生产过程中，使用化学杀菌剂依然是防治农作物病害的主要手段之一。然而随着杀菌剂频繁而大量的使用，不可避免地出现植物病原真菌的抗药性问题，抗性菌株在病原菌群体中的比例和抗性发生范围不断升高，抗性水平逐渐加剧，甚至出现了对不同作用机制杀菌剂均产生抗性的病原菌群体，即多药抗性[1-2]。多药抗性给病害的防治带来了极大的困难和挑战，导致一些地区田间杀菌剂的用量需要不断增加，一方面降低了农作物的产量，提高了农业生产成本，另一方面也给生态环境安全造成了不可逆的影响。

植物病原菌的抗药性问题尤其是多药抗性的治理已成为植物病害防治领域的世界性难题。因此，基于新颖的靶标蛋白，创制绿色、高效、安全的杀菌剂，并开展科学合理的抗性监测和管理是解决病原菌现有抗性问题的重要途径。氧化磷酸化解偶联剂在植物病害防治中扮演重要角色，与其他杀菌剂相比，其作用机制独特，由于病原菌体内缺少相应的靶标位点，致使植物病原菌对解偶联剂的抗性现象并不常见。本文归纳总结了常见的解偶联剂品种，同时对其作用机制及植物病原菌对其的抗性分子机制研究现状展开论述，旨在丰富人们对解偶联剂的认识，有利于该类杀菌剂在田间的科学使用，同时为植物病原菌的抗性治理提供有效途径。

1 解偶联剂简介

Mitchell 化学渗透假说解释了氧化与磷酸化之间的偶联机制，而解偶联剂作为一种氧化磷酸化抑制剂，可特异性地靶向线粒体膜电位，与线粒体膜间隙中的质子 (H+) 结合，从而以质子化的形式穿越线粒体内膜，同时将质子带回线粒体并释放到基质中，以此消除线粒体内膜两侧的H+浓度梯度。丧失质子驱动力的三磷酸腺苷 (ATP) 合成酶无法正常催化二磷酸腺苷 (ADP) 的磷酸化，因而无法形成ATP[3]。在线粒体呼吸链电子传递过程中，解偶联剂并未发挥抑制作用，反而在一定程度上还可以促进电子传递，加快糖、脂肪以及蛋白质等物质的消耗，同时刺激线粒体加速耗氧进程，而在此过程中释放的自由能会以热量的形式散失[4-5]。

杀菌剂抗性行动委员会 (Fungicide Resistance Action Committee, FRAC) 的杀菌剂分类表中列出的全球商品化的解偶联剂共有3 个：氟啶胺(fluazinam)、乐杀螨 (binapacryl) 和硝苯菌酯(meptyl dinocap) (https://www.frac.info/)，其结构式见图式1。研究表明，乐杀螨对苹果白粉病具有较高的防治活性[6]，而硝苯菌酯兼具保护和治疗活性，主要用于防控蔬菜、水果以及观赏植物上的白粉病[7-8]。氟啶胺是20 世纪80 年代初由日本石原产业株式会社开发上市、现阶段广泛应用于农业生产中植物病害防治的解偶联剂品种。鉴于氟啶胺抑菌活性高，作用机制独特，且田间少有抗性情况发生，我国沈阳化工研究院有限公司以其为基础进行衍生化合成，在“十一 ·五”期间创制了与氟啶胺具有相似化学结构的杀菌剂新品种双苯菌胺 (SYP-14288，图式1)。

图式 1 几种解偶联剂和双苯菌胺的结构式Scheme 1 Structural formula of several uncouplers and SYP-14288

氟啶胺作为氧化磷酸化解偶联剂，表现出高效广谱的抑菌活性，对植物病原菌的各个生长发育阶段均有较强的抑制作用，已被登记用于防治多种真菌、卵菌以及细菌病害[9-13]，其单剂已在马铃薯、番茄、柑橘等10 种作物多种病虫害防治中登记使用，如表1 所示。此外，氟啶胺与其他杀菌剂的复配制剂在中药材根腐病、水稻恶苗病、葡萄霜霉病、黄瓜霜霉病、花生根腐病及油菜菌核病上也获得了登记 (http://www.chinapesticide.org.cn/)。与氟啶胺相比，双苯菌胺同样表现出高效、低毒、广谱的特点，对多种植物病原菌均表现出良好的抑菌活性，同时其对辣椒疫霉Phytophthora capsici、致病疫霉P.infestans和黄瓜疫霉P.drechsleri的抑菌活性更高，且合成成本更低，具有广阔的应用前景[14-15]。

2 解偶联剂作用机制的探索

2.1 氟啶胺

自氟啶胺问世以来，有关该药剂的作用机制在不断探索中。在研究氟啶胺对小鼠肝脏线粒体的影响时发现，随着氟啶胺处理浓度的升高，线粒体呼吸作用增强。加入底物琥珀酸盐后，线粒体产生质子梯度势，亲脂性阳离子四苯基膦(tetraphenylphosphonium, TPP+) 可利用质子梯度势被动运输跨膜进入线粒体。加入氟啶胺后，TPP+不能跨膜进入线粒体，线粒体的质子梯度势被破坏，线粒体呼吸增强，表现出强烈的解偶联活性。在加入谷胱甘肽后，解偶联作用显著下降，推测可能是谷胱甘肽取代了氟啶胺结构中苯环上的氯原子，进而影响了氟啶胺的稳定性，最终导致其失去解偶联活性[16]。至此，氟啶胺首先被确认为典型的解偶联剂，但随后研究又发现，氟啶胺能显著抑制人体神经瘤细胞SH-SY5Y 线粒体呼吸链中复合物I 的活性，通过刺激细胞色素c 释放进入细胞质，使得细胞中的活性氧含量极剧增多，多巴胺含量显著降低，线粒体功能受损，细胞的能量合成遭到抑制，最终引起细胞死亡[17]。Vitoratos[18]在研究氟啶胺对玉米黑粉菌Ustilago maydis的作用方式时，对筛选获得的抗氟啶胺突变体进行了交互抗药性分析。结果发现，氟啶胺与萎锈灵、寡霉素具有一定的正交互抗药性，而与解偶联剂2,4-二硝基苯酚无交互抗药性，推测氟啶胺通过直接抑制ATP 合成酶来抑制真菌细胞的能量产生过程，并非具有氧化磷酸化解偶联活性。研究者在探究氟啶胺对灰葡萄孢Botrytis cinerea的毒理作用时，首先通过筛选酿酒酵母突变体库，获得了与毒理过程密切相关的基因，分析后发现这些基因集中于氨基酸代谢、能量代谢、核酸转录以及跨膜转运等途径，随后在灰葡萄孢中鉴定到可能参与以上代谢途径的4 个基因：BcStr2、BcElp4、BcMtg2和BcMtp1，进一步采用遗传转化方法明确了它们在灰葡萄孢对氟啶胺敏感性以及菌体生长发育方面具有重要作用[19]。尽管如此，有关氟啶胺的作用机制尚不明确。

2.2 双苯菌胺

Cai 等[20]采用同位素标记相对和绝对定量技术来探究双苯菌胺对辣椒疫霉的作用方式，通过对筛选获得的差异蛋白进行同源蛋白簇分析和KEGG 通路分析，发现大多数差异蛋白与病原菌碳水化合物代谢、能量代谢以及下游生物学功能特别是氧化还原酶活性和ATP 合成途径方面密切相关。同时研究发现，跨膜转运蛋白和应激反应相关蛋白质的上调表达可能具有协同作用，以补偿被破坏的质子梯度和其他下游效应，推测双苯菌胺具有解偶联活性，通过抑制能量代谢而影响其他生物学过程。Wang 等[21]在研究双苯菌胺对辣椒疫霉的作用机制时，对药剂处理后辣椒疫霉的差异代谢物进行分析，发现棕榈酸、硬脂酸和油酸等脂肪酸大量积累，这与典型的解偶联剂2,4-二硝基苯酚影响脂肪酸积累表现一致[22]，表明双苯菌胺可能在破坏病原菌氧化磷酸化偶联后导致各种脂肪酸积累，从而抑制植物病原菌的生长。Liang 等[23]联合代谢组学和生理生化测定探究了双苯菌胺对立枯丝核菌Rhizoctonia solani的作用机制，通过立枯丝核菌代谢指纹对典型的呼吸作用抑制剂进行聚类分析，结果表明：氧化过程抑制剂氟嘧菌胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、萎锈灵和噻呋酰胺聚为一支；磷酸化过程抑制剂三苯基氯化锡、三苯基乙酸锡、寡霉素A、甲芬那酸、2,4-二硝基苯酚和氟啶胺聚为另外一支，双苯菌胺与后者聚在一起。进一步对呼吸作用相关指标检测表明，双苯菌胺可以促进菌丝的呼吸速率，降低膜电位，并显著抑制ATP 合成。以上两方面试验结果证明了双苯菌胺具有解偶联活性。但是，截至目前，有关氟啶胺和双苯菌胺的研究，并未监测到药剂与线粒体膜间隙中的质子 (H+) 发生结合，并以质子化的形式穿越线粒体内膜这一过程，有待于进一步研究探明。

3 病原菌对解偶联剂抗性机制的解析

植物病原菌对杀菌剂产生抗性的机制主要包括靶标抗性和非靶标抗性。靶标抗性主要涉及靶标基因的点突变及过量表达，这也是病原菌最为常见和报道最多的抗性机制[24]。非靶标抗性指的是病原菌中外排转运蛋白的过量表达和解毒代谢酶的参与增加了对药剂的排泄或代谢解毒，减少了药剂在细胞内的积累，从而表现抗药性，甚至出现多药抗性，即某类病原菌不仅对相同作用机制的杀菌剂产生抗性，同时也能对作用机制不同的杀菌剂产生抗性[25]。

3.1 氟啶胺

由于解偶联剂具有独特的作用机制，在病原菌体内尚未发现解偶联剂作用的靶标蛋白，因而难以在抗性突变体中寻找发生变化的氨基酸位点。植物病原菌对该类药剂抗性研究报道较少，目前仅有Tamura[26]研究报道了病原菌对氟啶胺的田间抗性，其在菜豆田发现了灰葡萄孢对氟啶胺表现抗性的菌株。Schepers 等[27]在荷兰马铃薯晚疫病田中分离获得新的致病疫霉基因型菌株，其在田间高病害压力下，对氟啶胺的敏感性显著下降。Vitoratos[18]在室内通过化学诱变方法获得了玉米黑粉菌对氟啶胺的抗性突变体，并发现其与萎锈灵、寡霉素具有交互抗性，但对线粒体解偶联剂表现为敏感，表明植物病原菌对氟啶胺抗性机制与菌体能量系统密切相关。

Shao 等[28]开展了灰葡萄孢对氟啶胺的抗性风险评估，通过室内驯化获得5 株抗性突变体，其生存适合度显著低于亲本菌株，表明灰葡萄孢对氟啶胺抗性风险较低，但同时发现所有的抗性突变体对腐霉利和咯菌腈均表现出抗性，同时对渗透胁迫高度敏感，这暗示着灰葡萄孢对氟啶胺的抗性可能与其对腐霉利和咯菌腈的抗性具有相似的机制。Mao 等[29]通过室内药剂驯化的方式筛选获得了9 株抗氟啶胺的核盘菌Sclerotinia sclerotiorum突变体，对其生存适合度测定后发现其对氟啶胺具有低水平的抗性风险，但突变体对咯菌腈的敏感性降低，这表明在核盘菌中，氟啶胺和咯菌腈之间存在潜在的交互抗性，这与Shao 等[28]的研究结果类似，但在抗氟啶胺突变体中并未检测到组氨酸激酶基因点突变，且咯菌腈的靶基因仅在部分抗性突变体中上调表达，表明核盘菌对氟啶胺的抗性与组氨酸激酶基因点突变或过表达无关。同时观察到抗性突变体对渗透胁迫表现敏感，猜测突变体中与渗透调节相关的信号途径里基因的变化导致其对咯菌腈敏感性降低，这些基因有可能是导致病原菌对氟啶胺产生抗性的关键因子。

3.2 双苯菌胺

本课题组前期围绕双苯菌胺开展了系统的抗性机制研究。侯燕华[30]评估了辣椒疫霉对双苯菌胺的抗性风险，并初步探究了抗性机制。通过室内筛选获得了系列抗性突变体，抗性水平在3～150 倍之间，抗性较为稳定，通过综合突变体生存适合度以及交互抗药性测定，明确了辣椒疫霉对双苯菌胺具有低水平抗性风险。ATP 合酶5 个亚基编码基因在抗性菌株和敏感菌株体内均未发生点突变，而对突变体ATP 合酶的8 个亚基和ATP 酶的4 个亚基表达量测定结果表明，两类基因的下调表达可能是导致抗性发生的原因。刘鹏飞等[31]研究表明，相较于亲本菌株，辣椒疫霉抗药突变体对百菌清和氟噻唑吡乙酮的敏感性均降低，并且突变体对杀菌剂的敏感性在外排蛋白抑制剂阿米替林作用下得以恢复。梁莉[32]研究发现，双苯菌胺对立枯丝核菌具有较高的抑制活性，通过药剂驯化的方式筛选获得一系列抗双苯菌胺突变体，经过10 次转代培养后，突变体的抗性水平介于20～100 倍之间，且多数抗性突变体对双苯菌胺的敏感性变化较为稳定，但相关抗性机制研究并未深入开展。

代探等[33]在探究辣椒疫霉对双苯菌胺的抗性机制时，通过高效液相色谱法 (HPLC) 检测了敏感菌株JA8 和抗性菌株RJ-2 菌丝中双苯菌胺的积累量，发现双苯菌胺在敏感菌株中的积累量显著高于其在抗性菌株中，推测药剂外排造成了辣椒疫霉抗药性的发生。选用11 种已知作用机制的外排泵抑制剂与双苯菌胺复配进行增效性研究，探寻与双苯菌胺抗性相关的外排蛋白，最终成功筛选到具有增效作用的抑制剂阿米替林，其靶标蛋白为P-糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp)。进一步测定辣椒疫霉P-gp基因的表达量，其中P-gp9606、Pgp5690、P-gp14335和P-gp5260984 个基因在抗性菌株中过量表达，表明辣椒疫霉可通过P-gp基因的过量表达介导药剂外排，从而对双苯菌胺产生抗药性。此外，通过液相色谱-质谱联用 (LCMS) 方法检测到双苯菌胺在辣椒疫霉抗性菌株和敏感菌株菌丝中的3 种代谢产物，根据一级质谱数据分析推测代谢产物的结构均是由双苯菌胺母体的一个“-NO2”还原为药剂代谢产物“-NH2”的转变，且这种还原反应由细胞色素P450 单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, P450) 参与完成。进一步测定辣椒疫霉34 个P450 基因的表达量，发现其中7 个P450 基因与3 种代谢产物可能存在一一对应关系。以上结果表明，P450s 作为重要的解毒蛋白，可能在辣椒疫霉对双苯菌胺的抗性中发挥重要作用。

笔者所在研究团队以课题组前期通过双苯菌胺驯化筛选获得的水稻纹枯病菌Rhizoctonia solaniKühn 抗性突变体为研究材料，开展病原菌对双苯菌胺抗性机制研究。首先根据交互抗药性的测定结果，明确了双苯菌胺与氟啶胺、2,4-二硝基苯酚、咯菌腈、苯醚甲环唑、氰霜唑、百菌清以及三苯基氯化锡均具有正交互抗药性，表明在双苯菌胺作用下，抗性突变体产生了多药抗性。通过高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱联用 (HPLCQTOF) 方法分析获得了双苯菌胺在水稻纹枯病菌中产生“-NO2”还原为“-NH2”的代谢产物以及“-Cl”取代为“-NH2”的代谢产物。其中，还原产物在抗性突变体内的积累量显著增加，表明抗性突变体对双苯菌胺较强的代谢能力是导致其抗性发生的重要原因。通过HPLC 检测双苯菌胺在抗性突变体X19-7 和亲本菌株X19 菌丝中的积累量，发现随着处理时间的延长，突变体的药剂积累量显著低于亲本菌株，分析抗性菌株可能发生了药剂的外排或者代谢，从而介导了抗性[34]。

对抗性突变体和亲本菌株进行转录组分析，筛选获得了与药剂解毒代谢和外排转运相关的蛋白。进一步通过q R T-P C R 进行验证，发现P450 基因、谷胱甘肽巯基转移酶 (glutathioneStransferase, GST) 基因以及ATP 结合盒 (ATPbinding cassette, ABC) 和主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS) 编码基因在抗性突变体中均显著上调表达。进一步对这些上调表达基因进行酵母异源表达验证，发现P450 基因AG1IA_05136、GST 基因AG1IA_07383、ABC转运蛋白编码基因AG1IA_06082和MFS 转运蛋白编码基因AG1IA_08645的转化子对不同作用机制杀菌剂的敏感性均发生了显著下降，其中P450 基因转化子中双苯菌胺代谢产物显著增加，两个还原代谢产物的产生量分别约为空载体转化子的5 倍和10 倍。而ABC 和MFS 基因转化子对母体外排剂量显著上调，与空载体转化子相比，酵母转化子BY4741:AG1IA_06082 和BY4741:AG1IA_08645 在药剂处理后的6 h 和12 h 外排量分别上调1.97 倍、2.09 倍和2.46 倍、2.63 倍[34-35]。以上结果均表明，代谢和外排相关基因的过量表达是导致水稻纹枯病菌多药抗性发生的重要原因。

不同病原菌对氟啶胺和双苯菌胺的抗性机制报道列于表2。

表2 不同病原菌对氟啶胺和双苯菌胺的抗性机制Table 2 The resistance mechanism of different pathogens to fluazinam and SYP-14288

4 抗药性治理

针对靶标蛋白氨基酸位点突变引起的病原菌对杀菌剂的抗性，可以通过药剂的轮换使用来治理，但病原菌通过代谢解毒或药剂外排产生抗药性以及多药抗性，严重情况下很可能导致病害面临无药可治的局面。寻找具有杀菌增效性的抑制剂物质可以为病原菌抗性治理提供潜在应用手段。使用外排蛋白抑制剂联合抗真菌药物来延缓真菌耐药性已经在临床上得以应用。利用外排蛋白抑制剂来抑制相应外排蛋白的过量表达，从而抑制其对药物的外排作用，提高细胞内药物浓度以发挥其最大的抑菌活性[36]。这为临床治疗由真菌引起的感染提供了理论依据，但同时也存在着一定的隐患，即外排抑制剂在发挥自身功能的同时，会对正常的细胞组织造成损害，因此使用前必须对其安全性进行全面的评估。

在农业生产领域，使用外排蛋白抑制剂或者代谢酶抑制剂如细胞色素P450 酶或谷胱甘肽巯基转移酶抑制剂可以有效逆转杂草和昆虫的外排抗性或代谢抗性。Shan 等[37]研究发现，3 种ABC 转运蛋白的过量表达介导了小菜蛾对杀虫剂氯虫苯甲酰胺的抗性，而将外排抑制剂维拉帕米和药剂混合使用时可以有效提高抗性群体的死亡率。P450 基因CYP6CM1的过量表达介导了烟粉虱对吡虫啉的抗性，而使用P450 酶抑制剂胡椒基丁醚能够通过抑制P450 酶的活性而提高害虫对杀虫剂的敏感性[38]。GST 抑制剂4-氯-7-硝基苯并噁二唑能够有效抑制AmGSTF1 的活性，以此恢复黑草对多种除草剂的抗性[39]。在病原菌中，针对外排抗性或代谢抗性导致的多药抗性治理尚缺乏系统的研究，目前对相关增效剂的探索主要集中在灰葡萄孢的多药抗性上。陈晨[40]筛选获得了ABC 转运蛋白抑制剂法尼醇和利血平，研究发现，二者与不同作用机制的杀菌剂分别以一定比例复配，能够促进药剂在灰葡萄孢体内的积累，从而提高杀菌剂的活性。孙铭优[41]研究发现，盐酸小檗碱可以有效抑制灰葡萄孢ABC 转运蛋白的活性，其与不同作用机制的杀菌剂复配使用后，对灰葡萄孢多药抗性菌株表现出增效作用，能够作为防控多抗菌株的有效手段。代探[42]在探究病原菌对解偶联剂的抗性机制时发现，外排泵抑制剂阿米替林和维拉帕米与双苯菌胺复配对辣椒疫霉抗性菌株表现出增效。该研究结果表明，一方面能够根据抑制剂的作用机制寻找到与病原菌抗药性相关的靶标蛋白，另一方面可为应用外排抑制剂延缓病原菌对杀菌剂的抗性提供理论支持。

研究发现，双苯菌胺可通过影响水稻纹枯病菌代谢和外排相关基因过量表达介导病原菌多药抗性的发生，基于P450 和GST 这两类基因过量表达导致水稻纹枯病菌产生代谢抗性，筛选出对杀菌剂具有增效作用的代谢酶抑制剂马来酸二乙酯和黄烷酮，二者显著提高了突变体X19-7 对不同供试杀菌剂的敏感性，这为植物病原菌的多药抗性治理提供了新的思路[43-44]。

尽管具有杀菌剂增效作用的抑制剂能够为植物病原菌的抗性治理提供潜在的解决方案，但这些抑制剂在实际生产中的应用前景和使用效果仍有待于通过田间试验进行验证。同时，对抑制剂的生物和环境安全性也需要进行全面、系统的评估。此外，抑制剂在田间的使用成本也须充分考虑，开源节流，从而最大限度地确保农作物的产量和品质。

5 小结

截至目前，植物病原菌对以氟啶胺为代表的解偶联剂在田间的抗性发展较为缓慢，但在实验室药剂驯化条件下，已获得一系列对双苯菌胺和氟啶胺抗性倍数较高的病原菌抗性突变体，并表现出对不同作用机制药剂敏感性均下降的情况，说明该类药剂具有导致病原菌多药抗性的潜在风险。随着氟啶胺在我国各类作物病害防治中登记范围的扩大和进一步推广应用，该类药剂的抗性风险值得关注。已有研究揭示出植物病原菌对解偶联剂的抗性分子机制包括P450 和GST 参与的代谢抗性机制，以及ABC 和MFS 转运蛋白参与的外排抗性机制，其中有关代谢抗性的研究结果丰富了杀菌剂抗性研究体系。有关田间病原菌的多药抗性在我国果蔬灰霉病和草坪币斑病上已被频繁报道，其田间成因是否与某些药剂的使用有关尚不清楚。而植物病原菌的多药抗性问题轻则降低农药防效，需要加大田间用药量，从而需要增加成本投入，影响环境安全，重则可造成病害无药可治的局面，这对具有全新作用机制杀菌剂的创制提出更高的挑战。植物病原菌对解偶联剂抗性机制的揭示为病原菌多药抗性形成机制的解析提供了参考，也为在病原菌抗性治理中增效剂的应用提供了科学依据。