核酸农药纳米递送系统研究进展

何承帅, 张 辉, 吴顺凡, 高云昊, 高聪芬

(南京农业大学 绿色农药创制与应用技术国家地方联合工程研究中心，植物保护学院，南京 210095)

化学防治是防控农业有害生物的有效措施，在保障粮食安全方面有着不可或缺的地位。据统计，全球每年由病虫害导致的作物产量损失在30%～40%[1]，使用化学农药可至少挽回30%的产量损失。化学农药具有使用方便、防治速度快、防治效果好等优点，但长期或不合理使用可能引致防治对象对农药产生抗性、农药对非目标生物的毒副作用以及环境污染等一系列问题。因此，寻找高效且安全的新型绿色农药是农药行业发展的重要方向。

RNA 干扰 (RNA interference，RNAi) 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (doublestranded RNA，dsRNA) 诱发的、同源信使RNA(messenger RNA，mRNA) 高效特异性降解的现象，可通过抑制转录前水平或转录后水平的基因表达而诱导功能缺失的表型[2]。核酸农药是一类可以特异性地结合靶标生物中特定基因转录的mRNA 的多核苷酸，通过靶标生物体内天然存在的RNAi 系统沉默相应基因的表达，从而干扰靶标生物的正常生长及其对寄主植物的危害，最终达到保护植物目的的植物保护剂[3]。核酸农药具有特异性强、见效周期短、无残留和对非靶标生物影响较小等优势，被誉为农药史上第3 次革命，是新型绿色农药创制领域的热点[4]。近年来，基于RNAi技术的核酸农药已逐渐走向市场[3,5]。目前，核酸农药在农业有害生物防治方面的应用方式主要包括以转基因作物为主的转基因植物核酸农药和直接喷施dsRNA 为主的可喷洒核酸农药两种类型[3,6]。相较于具有潜在风险的转基因植物核酸农药，外源施用的可喷洒核酸农药更符合公众对农药的认知，更具应用前景和市场潜力，是未来核酸农药的理想应用方式。然而，体外应用dsRNA在环境中不稳定，易被RNA 降解酶、紫外光和高温降解[7-8]，难以有效地导入靶标生物体内等技术难题，严重限制了可喷洒核酸农药的实际应用效果。

纳米材料具有纳米尺度下的小尺寸效应、界面效应以及良好的生物兼容性等特点，其作为dsRNA载体可以增强dsRNA 在环境中的稳定性和进入目标生物组织或细胞的能力，进而提高靶向递送效率，是解决核酸农药外源施用难的有效手段[9-12]。近年来，随着纳米材料的快速发展和dsRNA 高效合成技术日渐成熟，基于纳米材料的核酸农药纳米递送系统在有害生物防治方面取得了一系列重要的进展。鉴于此，本文对核酸农药的应用方式与挑战、产业化进展、基于纳米材料的核酸农药纳米递送系统及其国内外应用研究进展进行综述，并对核酸农药纳米递送系统的前景和面临的挑战进行展望，旨在为核酸农药在农业有害生物绿色防控中的推广应用提供参考。

1 核酸农药的应用方式与挑战

自从1998 年Fire 等[13]在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans中发现RNAi 现象以来，开发基于RNAi 原理的核酸农药应用于保护植物和防治有害生物方面就受到广泛关注并取得了重要进展。之前龚流娥等[14]、王治文等[3]在影响RNAi 效率的主要因素、核酸农药防治原理及应用现状等相关方面进行了综述，本节侧重于讨论核酸农药在病虫害防治中应用方式的研究进展与挑战。

1.1 转基因植物核酸农药

转基因植物核酸农药可以通过转基因作物生产传递针对害虫致命基因的dsRNA 或者小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，从而赋予作物自身防御病虫害的能力[15-16]。转基因作物可以通过植物细胞产生dsRNA/siRNA，而后经过食物链进入靶标生物体内，打破dsRNA/siRNA 稳定供应的限制，从而触发持续的RNAi 反应。转基因作物自身表达dsRNA 或者siRNA 的转基因植物核酸农药在有害生物管理方面具有成本低、稳定表达和高特异性等诸多优势[17]。

目前，新型的叶绿体转基因技术可以让dsRNA 稳定地在叶绿体中积累而不会被自身的RNAi 元件 (Dicer 酶) 切割降解，其克服了基于常规细胞核转基因技术的转基因植物核酸农药会被植物自身RNAi 系统识别切割，进而影响RNAi 效率和防控效果的应用难题[18-20]。然而，转基因植物核酸农药仍具有一定的局限性，例如：许多作物无法进行基因改造[8]；在水稻、小麦和玉米等主要粮食作物上难以开发叶绿体转化方案[5]。此外，转基因作物的农产品在大多数国家具有较低的市场公众接受度，对其潜在的环境风险需要进行严格的风险评估[21-23]。

1.2 可喷洒核酸农药

近年来，利用喷雾诱导基因沉默 (spray-induced gene silencing，SIGS) 技术在植物表面应用可喷洒核酸农药进行农业有害生物防治的方式受到了核酸农药研究领域的广泛关注[24-26]。与传统化学农药相比，可喷洒核酸农药具有对靶标生物的高特异性和快速自然降解的优点[27-29]。

随着对核酸农药研究的不断深入，关于叶面喷施核酸农药进行有害生物防治的研究越来越多。2001 年，Tenllado 等[30]首次报道了叶面应用dsRNA 可成功干扰辣椒轻斑驳病毒 (pepper mild mottle virus，PMMoV)、苜蓿花叶病毒 (alfalfa mosaic virus，AMV) 和烟草蚀纹病毒 (tobacco etch virus，TEV) 对烟草Nicotiana tabacum的侵染。Koch 等[31]研究表明，在大麦Hordeum vulgare叶片表面喷洒靶向3 个禾谷镰刀菌Fusarium graminearum麦角甾醇生物合成基因 (CYP51A、CYP51B、CYP51C) 的dsRNA (CYP3-dsRNA)，可有效抑制禾谷镰刀菌的生长。Wang 等[32]发现，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在侵染植物时可以将siRNAs(主要由灰葡萄孢菌Dicer 蛋白BcDCL1 和BcDCL2产生) 传递到植物细胞中，以沉默宿主免疫基因；在植物表面应用靶向灰葡萄孢菌DCL1 和DCL2基因的siRNA 或dsRNA 可削弱这种沉默，进而显著抑制灰霉病。李本杰等[33]在马铃薯Solanum tuberosum叶面上施用针对马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata肌动蛋白基因的dsRNA，能够有效防治该类害虫28 d 以上。Andrade 等[34]用靶向亚洲柑橘木虱Diaphorina citri精氨酸激酶基因的dsRNA 处理柑橘Citrus sinensis叶片，发现柑橘木虱取食后会因精氨酸激酶基因的表达受到干扰而死亡。

与转基因植物核酸农药相比，可喷洒核酸农药因开发时间短、开发成本低、抗性风险低、调控过程简单及对所有作物的可行性高而备受青睐[35]。喷施操作便捷且应用场景多样，是核酸农药未来主要的应用方式。然而，可喷洒核酸农药在实际应用中也受到诸多因素的限制。例如：植物细胞和大多病原菌细胞具有由纤维素等物质构成的较厚且坚硬的细胞壁，厚度从0.1 μm 到几个微米不等，这对核酸农药的传递构成了物理障碍[36-37]；昆虫中肠内的内切酶可以降解进入体内的dsRNA，从而降低昆虫的RNAi 效率[38-40]。此外，dsRNA 在环境中的降解也是RNAi 无效诱导的主要原因[28,41-44]。

2 核酸农药的产业化进展

在过去的几十年里，随着生物技术迅速发展，核酸农药作为一种新兴的农业防治手段引起了广泛关注。通过对潜在靶基因的筛选和功能分析，以及基于RNAi 的作物保护和作物改良策略的设计，部分核酸农药已成功实现产业化。

2.1 转基因植物核酸农药

2017 年，孟山都公司 (现已被拜耳公司收购)利用一种天然高效的转基因载体——农杆菌 (属于革兰氏阴性细菌) 将目的基因转入受体品种中，开发了一种可以同时表达苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis，Bt) Cry3Bt1 蛋白和西方玉米根甲虫Diabrotica virgifera virgifera Snf7基因dsRNA 的商业转基因玉米MON87411，并获得美国环境保护署 (EPA) 批准，成为全球获批的首项基于RNAi技术控制害虫的核酸农药[45]。该产品创新性地通过将RNAi 技术与Bt 毒素相结合的方式，改善了对西方玉米根甲虫的控制[46]。2021 年，该产品成功获得了中国农业农村部科技教育司颁发的转基因生物安全证书 (进口) 批准 (http://www.kjs.moa.gov.cn/gzdt/202101/t20210113_6359909.htm)，主要用作加工原料。同年，欧盟委员会批准了该产品用于食品和饲料的加工原料[47]。2022—2023 年，拜耳公司在美国和加拿大对该产品进行了商业化种植与推广[48]。

宿主诱导的基因沉默并不局限于对害虫的控制，一些使用RNAi 来改善作物质量的产品也已被授权批准，或将在不久的将来进入市场。例如，2018 年，拜耳公司通过农杆菌介导转化传统大豆Glycine max得到含有FAD2-1A/FATB1Ab(脂肪酸生物合成途径关键基因) 表达抑制盒和cp4-epsps耐除草剂基因的转基因大豆MON87705，该产品可以改良大豆脂肪酸组成，并对除草剂草甘膦具有抗性，目前该产品在美国、加拿大和日本已被批准用于食品和饲料的加工原料以及商业化种植，在欧盟已被批准用于饲料和食品的加工原料[47]。2022 年，美国农业部动植物卫生检验局(APHIS) 解除了同样采用农杆菌介导的转基因马铃薯Z6 的管制。在该马铃薯品种中，RNAi 介导的靶基因沉默可以防止马铃薯擦伤，减少丙烯酰胺的含量，并提高淀粉质量[49]。然而，这种基于农杆菌侵染植物实现核酸农药递送的方式仍然存在不足之处。例如，农杆菌转化的受体物种有限，单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，往往具有较低的转化率和外源基因表达水平，大多数单子叶植物无法通过农杆菌进行转化[50]。

2.2 可喷洒核酸农药

基于SIGS 技术的可喷洒核酸农药不需要植物转化就可以为植物提供病虫害的高度定向保护，不受因植物转化所涉及的技术挑战以及获得监管批准的时间和成本的限制，近年来得到了蓬勃发展。2019 年，拜耳公司向EPA 提交了全球首个可喷洒核酸农药新产品BioDirect，该产品可显著降低养蜂业的主要害虫狄斯瓦螨Varroadestructor的存活率，却对蜜蜂没有影响[47]。2021 年，拜耳将该产品专利授权给Greenlight Biosciences 公司进行生产，新产品预计2024 年上市[6]。马铃薯甲虫因其对RNAi 反应的高度敏感性成为了核酸农药公司研发可喷洒核酸农药的焦点。2021 年，先正达公司在田间验证了直接喷洒dsRNA 用于控制马铃薯甲虫的可行性，相关产品预计在7～10 年内实现商业化[51]。2022 年，Greenlight Biosciences 公司研发的可喷洒核酸农药ledprona 通用名获得国际标准化组织 (ISO) 的批准 (https://committee.iso.org/)，叶面喷施该产品可以有效防治马铃薯甲虫，Greenlight Biosciences 公司就该产品已向EPA 提交申请登记。

总体而言，核酸农药产业化进展迅速，为农业可持续发展提供了新的选择。随着核酸合成技术的进一步成熟和市场需求的增加，核酸农药在未来将得到进一步的研发和推广，同时可喷洒核酸农药展现出良好的商业化前景。可喷洒核酸农药的应用效率与dsRNA 在环境中的稳定性密切相关，研发安全高效的保护递送系统已成为克服可喷洒核酸农药产业化瓶颈的前沿热点。

3 纳米材料介导的核酸农药纳米递送系统

核酸农药在农业领域具有巨大的应用潜力和商业价值，然而，其应用效果受环境因素影响较大，喷洒使用后易降解失效，严重限制了核酸农药的广泛应用。近年来，纳米科技的迅猛发展为安全、高效、稳定地向靶标对象 (植物、昆虫等)递送核酸农药提供了新途径，基于纳米材料负载核酸农药的纳米递送系统 (图1) 相关研究备受关注。

图1 纳米材料介导的dsRNA/siRNA 传递系统示意图Fig.1 Schematic representation of nanomaterial-mediated dsRNA/siRNA delivery systems

3.1 纳米材料的优势

国际上关于纳米材料和纳米尺度的定义尚无统一规定[52-53]。我国关于纳米材料的定义为任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度 (1～100 nm)的材料称为纳米材料 (https://openstd.samr.gov.cn/bzgk/gb/)。纳米材料作为新兴的核酸递送载体，在提高核酸农药转染效率、干扰效率和稳定性等方面具有独特优势。

1) 提高转染效率。据报道，由介孔二氧化硅纳米颗粒、层状双氢氧化物纳米片和碳纳米管等纳米材料负载DNA 或RNA，可在没有机械辅助(例如基因枪、超声波、涡旋和电穿孔等) 条件下穿透植物细胞和病原菌细胞的细胞壁，从而产生瞬时或稳定的转化[54]。纳米材料介导的转化方式已成功应用于烟草、玉米、拟南芥、洋葱等作物，展现出普适性[55]。

2) 提升干扰效率。Avila 等[56]设计了一种基于两亲性肽的纳米胶囊负载BiP(Binding protein) 基因 (编码内质网热休克蛋白) 的dsRNA，饲喂法生物测定结果表明，相较于裸BiP-dsRNA，BiPdsRNA 纳米胶囊可缩短豌豆蚜Acyrthosiphon pisum幼虫的死亡时间，并显著提高赤拟谷盗Tribolium castaneum的死亡率。

3) 增加dsRNA 稳定性。纳米材料可以将dsRNA包裹在其表面或内部，其本身的尺寸和结构可以提供物理屏障，防止dsRNA 与酶相互作用，从而增强dsRNA 的稳定性。例如，Ma 等[57]利用一种星状阳离子聚合物纳米载体 (star polycation，SPc)对dseGFP进行负载后形成dsRNA/SPc 复合物，RNase A 酶和昆虫血淋巴处理不会造成复合物中dseGFP的降解，表明该纳米载体对dseGFP提供了强有力的保护作用。Christiaens 等[58]发现，鸟苷酸聚合物作为纳米载体可以防止外源dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua碱性肠道中的降解，证明了该类纳米材料对核酸具有高效保护性。此外，纳米材料还可以克服昆虫肠道围食膜、植物表皮以及昆虫体壁等障碍，进而显著提升RNAi效率和病虫害控制效果[9,11-12]。

3.2 核酸农药的负载

通过纳米材料的负载，可有效延长核酸农药在环境中的降解周期以及保护核酸农药免受生物机体的免疫识别。纳米材料应该具有结合或封装核酸分子的能力，这是其负载核酸农药的一个重要前提。通常情况下，带正电荷的纳米材料可与带负电荷的RNA 分子，通过静电作用形成dsRNA/siRNA-纳米材料复合物[59-60]。例如：壳聚糖含有大量的氨基，在生物微酸性条件下带有正电荷，其可以通过静电作用负载RNA，形成RNA-壳聚糖复合物[61-62]；树枝状阳离子聚合物的表面具有大量带正电荷的胺类官能团，可以与负电性的dsRNA/siRNA 结合，完成核酸农药的负载[63]。同样的，支链两亲性肽胶囊的表面具有大量的阳离子赖氨酸基团，其可以与核酸分子形成dsRNA/siRNA-支链两亲性肽胶囊复合物[64]。对于负载率低的无机纳米材料，可以对其表面进行多官能团 (-NH2、-CHO 和-OH 等) 修饰，使其通过化学偶联作用或者配体反应等与核酸分子结合[65-66]。Zhao 等[66]采用带正电荷的聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine，PEI) 对四氧化三铁磁性纳米颗粒 (magnetic nanoparticle，MNP) 进行表面修饰后作为DNA 载体，可以与电负性DNA 结合，并凝聚形成MNPDNA 复合物。Yang 等[67]利用阳离子聚酰胺树状分子 (polyamidoamine dendrimer，PAMAM) 来改善碳纳米管的功能特性，使其与带负电荷的siRNA 发生静电相互作用，从而增加碳纳米管对核酸分子的负载。脂质体可以通过将核酸分子包裹在其亲水内核，从而完成负载结合[60,68]，而脂质纳米颗粒则是通过具有的阳离子脂质与核酸物质通过静电络合作用在其内部形成胶束结构，从而完成核酸农药的负载[69]。

3.3 细胞摄取与内体逃逸

细胞摄取是影响核酸农药对宿主细胞有效生物利用度的重要因素。核酸农药纳米递送系统可以利用细胞壁间的孔洞 (例如花粉孔、叶面气孔)直接穿过细胞壁[70]。表面带有正电荷的核酸农药纳米递送系统可以与带有负电荷的细胞膜表面结合，在胞吞作用下进入细胞质，完成跨膜转运[53,59,71]。因此，具有正电荷的阳离子纳米载体材料较中性或阴离子纳米载体材料更容易被细胞摄取，表现出更高的细胞转染效率[71-72]。中国农业大学沈杰研究团队发现，dseGFP/SPc 处理可显著上调Sf9 细胞的Chc基因 (编码网格蛋白的包被凹坑和囊泡表面结构的主要多肽[73])、AP2S1基因 (编码AP2 异四聚体复合物的σ 亚单位，AP2 复合物是网格蛋白包被小泡的核心成分，促进膜蛋白的内吞作用[74])、Arf1基因 (ARF 蛋白通过募集各种辅助蛋白构成运输囊泡，是内吞作用中的关键蛋白[75])等关键基因的表达，激活网格蛋白介导的内吞通路，从而增强细胞对dsRNA 的摄取；进一步采用质子泵抑制剂 (抑制网格蛋白介导的内吞作用) 巴佛洛霉素A (bafilomycin-A，Baf A) 体外处理Sf9细胞后，dseGFP/SPc 无法激活细胞内的RNAi 效应；该研究证明了网格蛋白介导的内吞作用是细胞摄取SPc 介导的dsRNA 递送的主要途径[57]。

核酸农药纳米递送系统通过内吞作用被内化形成内吞囊泡，若其不能从内体及时逃逸，则会与内体一起进入溶酶体中从而降解，从而限制核酸农药的细胞生物利用度。目前研究表明，大多数RNA 纳米递送系统内体逃逸的重要机制为“质子海绵效应”[68,76]，即RNA 纳米递送系统进入内体后，为缓冲内体内的酸性环境而吸收大量质子，大量质子涌入内吞囊泡导致内体的渗透性水肿胀，最终导致内体破裂，完成内体逃逸[77-78]。值得注意的是，阳离子脂质纳米颗粒具有独特的内体逃逸机制，它们通过识别并结合内体膜上的磷脂分子，从而破坏内体的稳定性，完成内体逃逸并释放所负载的dsRNA/siRNA[79-80]。纳米递送载体或可以促进核酸农药的内体逃逸。例如，Ma等[57]通过激光共聚焦显微成像技术发现，与裸露的dsRNA 相比，dseGFP/SPc 孵育的Sf9 细胞的晚期核内体中没有dsRNA 的积累，表明SPc 纳米载体可以促进dsRNA 的内体逃逸。

3.4 核酸农药的释放

核酸农药纳米递送系统具有生物活性的本质是基于dsRNA/siRNA 的RNAi 作用。因此，dsRNA/siRNA 必须从纳米载体中释放出来才能激活RNAi途径，抑制靶标生物特异mRNA 的表达，最终发挥核酸农药的生物效应。然而，目前关于dsRNA/siRNA 从纳米载体中的释放机制研究报道相对较少。

2001 年，Moret 等[81]研究发现，肝素、硫酸软骨素等生物体内的聚阴离子可以解离稳定的DNA 与PEI 复合物PEI-DNA，释放DNA。2004年，Okuda 等[82]首次在体外证明了PEI-DNA 复合物在细胞质中的解离，并且发现阳离子含量比例低的阳离子聚合物类纳米材料-DNA 复合物可以自主释放DNA；该研究表明，具有较高亲和力的生物体内聚阴离子可以通过竞争结合，导致PEI-DNA的解离，并将DNA 释放到细胞质中。然而，这种竞争性的置换过程通常是非常缓慢的[83]。

纳米材料响应细胞内刺激而造成的核酸农药纳米递送系统结构崩解是另一种诱导核酸农药释放的机制。该类纳米材料自身的物理或化学性质可以在生物细胞内环境因素的刺激下发生响应性改变，如胞浆pH 值和氧化还原性的改变从而诱导递送系统结构崩解[83]。例如：聚(β-氨基酯) (poly(β-aminoester)s) 是一种基因递送常用的阳离子聚合物，其解离速率取决于环境pH 和组成聚合物的链构象[84-86]；含有二硫键 (S－S) 的核酸纳米递送系统在组织或细胞中谷胱甘肽的氧化还原刺激下，其二硫键被催化断裂，进而响应释放装载的核酸分子[87]。

3.5 基于纳米材料递送核酸农药的应用进展

基于RNAi 的病虫害防治技术正在给农药领域带来革命性的变化，因为其针对的是有害生物的遗传基因，而不是下游的蛋白质，这为许多棘手的病虫害防治提供了潜在的防治可能。为了解决核酸农药自身的局限性，开发能够促进核酸农药分子进入到靶标生物细胞的高效递送系统尤为重要。目前，基于载体的核酸农药递送系统按其递送载体的来源和性质，可以分为病毒类和非病毒类递送载体两种类型。病毒类载体是通过改造病毒来递送目标基因的常用工具，具有较高的细胞转染效率，但其存在制备工艺复杂、成本昂贵、可载入基因片段大小有限 (通常低于7 kb) 且容易引起机体免疫反应等缺陷，极大地限制了病毒类载体的应用[88]。而非病毒类递送载体因其具有低免疫性、低毒性和高安全性等优势逐步成为核酸农药递送载体领域的研究热点[89]。近年来，纳米材料作为新兴的非病毒类核酸递送载体，在新型核酸农药纳米递送系统的开发中得到了广泛的关注 (表1)。在此基础上，本小节对基于有机(脂质、聚合物、多肽) 和无机 (碳、层状双氢氧化物) 纳米材料的核酸农药纳米递送系统研究报道进行归纳综述。

3.5.1 基于脂质的纳米材料 基于脂质的纳米材料是一类用途极为广泛的非病毒类核酸载体材料，在各种生理环境下具有稳定的纳米结构，并且可以轻松地与各种生物膜结合，从而能够有效地递送核酸分子[60,108]。脂质通常被定义为疏水性或两亲性分子，在结构组成上包括一个亲水性的头部和一个疏水性的尾部，以及它们之间的连接物。基于脂质的纳米材料通常含有一定的脂质成分，如磷脂、胆固醇或聚乙二醇组分等。由于合成方法、脂质成分、形态结构等存在差异，目前用于核酸递送的脂质纳米材料可划分为脂质体与脂质纳米颗粒两种类型 (图2)[69,109]。

图2 脂质体 (左) 和脂质纳米粒 (右) 的示意图[109]Fig.2 Schematic representation of liposomes (left) and lipid nanoparticles (right)[109]

3.5.1.1 脂质体 脂质体是由脂质自组装成有序排列的双分子层封闭囊泡，具有亲水的内部空腔结构 (图2 左)。脂质体由于其良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及递送亲水和亲脂性药物的能力，已成为促进小分子和大分子传递的强大药物载体[110-111]。Lin 等[90]将靶向德国小蠊Blattella germanica微管蛋白基因 (α-tubulin，Tub) 的dsRNA(dsTub) 封装进脂质体中，发现脂质体可以有效防止该dsTub在中肠中的降解，饲喂dsTub/脂质体复合物的基因沉默效率达60%，显著提高了dsTub处理害虫的死亡率。类似地，Castellanos 等[91]利用脂质体2000 封装靶向ATP 酶 (vATPase A) 和肌肉肌动蛋白 (act-2) 的dsRNA，饲喂新热带区褐臭蝽Euschistus heros上述复合物，14 d 后可以导致45%和42%的试虫死亡，相较于裸露的dsRNA和dsRNA/EDTA 处理，dsRNA/脂质体系统具有更好的递送效果。尽管脂质体作为核酸农药载体有很大优势，但其合成方法较复杂，并需要使用大量的有机溶剂，这可能会不利于其大规模生产[111]。

3.5.1.2 脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒 (lipid nanoparticles，LNPs) 在广义上是指以脂质形成的纳米颗粒，是用来描述一种不同于脂质体的特定类型的纳米颗粒[109]。从组成上，LNPs 与脂质体的主要成分大致相同，都含有脂质和胆固醇，但形成LNPs 的脂质必须包含可电离脂质，而脂质体则对此没有严格的限制。从各成分比例上看，LNPs与脂质体之间存在较大的差异，尤其是中性辅助脂类 (胆固醇、磷脂等) 的用量，LNPs 需要物质的量之比 (摩尔比例) 在30%～40%的辅助脂类，才能有效封装dsRNA/siRNA[109]。从形貌来上，LNPs没有脂质体的亲水空腔，相反，其内部具有胶束结构[69,109](图2 右)。中国农业科学院烟草研究所任广伟团队采用PEI 修饰的LNPs 封装昆虫生长发育关键基因，即保幼激素受体基因 (Methoprenetolerant，Met) 的dsRNA，成功制备了Met3@PEI@LNPs 纳米复合物 (385 nm，-36.9 mV)，其细胞转染效率达到96.4%；饲喂法生物测定结果表明，在仅为对照组25%的dsRNA 浓度下，Met3@PEI@LNPs 处理的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda干扰效率仍高达91.7%，显著控制了草地贪夜蛾种群数量[92]。与脂质体相比，LNPs 具有更高的动力学稳定性和生物利用度，且易于大规模生产。

3.5.2 聚合物纳米材料 聚合物纳米材料 (polymer nanoparticles，PNPs) 是指由小分子化合物通过聚合反应形成的具有纳米尺度 (1～1000 nm) 的一类胶体材料，具有较高生物安全性、广泛结构多样性和良好生物降解性[112]。因具有易于合成、结构多样、高转染效率和生物相容性等特性，PNPs 成为了非病毒类核酸分子递送载体的主要材料，被广泛应用于基因治疗和核酸农药递送领域。

3.5.2.1 壳聚糖 壳聚糖是天然多糖甲壳素的脱乙酰化产物，含有羟基和氨基，是最常用的天然聚合物材料之一。由于具有低成本、易于降解和生物相容性等特点，壳聚糖纳米颗粒 (chitosan nanoparticles，CNPs) 已被广泛应用于dsRNA、siRNA、质粒、寡核苷酸、多肽、甚至蛋白质等生物分子递送[97,113-114]。Zhang 等[93]于2010 年首次利用CNPs (70 nm) 装载dsRNA，发现饲喂dsRNA/CNPs 复合物 (100～200 nm) 可以显著增加冈比亚按蚊Anopheles gambiae AgCHS1基因的沉默效率(62.8%)。Kumar 等[61]研究表明，dsRNA/CNPs 复合物 (100～200 nm，+12 mV，包封率85%) 可以明显抑制与翅膀发育相关的Vg基因的表达，显著提高埃及伊蚊Aedes aegypti3 龄幼虫的死亡率，延迟幼虫的生长发育，并导致成虫翅膀畸形。Lichtenberg 等[94]证明，采用dsRNA/CNPs (CNPs：15.6 nm ± 3.5 nm，+29 mV ± 4.0 mV) 浸泡处理秀丽隐杆线虫，比仅使用dsRNA 处理具有更高的转染效率和沉默效率；另外发现，CNPs 可以下调线虫体内肌凝蛋白的表达。Kolge 等[95]发现，CNPs(100 nm，+32 mV) 可以有效介导针对棉铃虫Helicoverpa armigera保幼激素甲基转移酶(Juvenile hormone methyltransferase，JHAMT) 和乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholine esterase，ACHE) 靶基因的dsRNA 的递送，提高dsRNA 沉默效率和抑制相关酶活性，室内生物测定结果表明，仅喷洒1 mL dsRNA/CNPs 复合物(200 μg:1000 ng)可使害虫死亡率达100%，且对非靶标生物黑腹果蝇Drosophila melanogaster和斜纹夜蛾Spodoptera litura无影响。类似地，CNPs (95 nm，+36 mV)可有效保护针对棉铃虫中性脂肪酶 (HaLipn 001)和几丁质酶靶基因的dsRNA 在昆虫肠道核酸酶和不同pH 条件下的降解，通过饲喂法测定发现，dsRNA/CNPs 复合物可有效地沉默脂肪酶和几丁质酶靶基因 (2.0～2.7 倍下调)，并抑制其酶活性(2.0～5.3 倍)[96]。

通过将壳聚糖与三聚磷酸钠 (tripolyphosphate，TPP)、叶酸、聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亚胺和葡聚糖硫酸盐等交联剂结合，可进一步提高其对dsRNA/siRNA 的保护能力，并提高转染效率和沉默效率[115-116]。例如，Dhandapani 等[97]将壳聚糖与TPP 交联，合成了粒径小于200 nm 载有dsRNA 的纳米复合物 (CS-TPPdsRNA)，其使埃及伊蚊的死亡率提高到60%以上，而同样条件下，dsRNA-壳聚糖纳米复合物(CS-dsRNA) 的死亡率仅为35%。Lyu 等[98]将松香改性的PEG 与壳聚糖交联 (rosin-modified polyethylene glycol and chitosan，ROPE@C) (418 nm，+26.5 mV) 负载褐飞虱Nilaparvata lugens(Brown planthopper，BPH) 体内几丁质合成酶基因A(Chitin synthetase A，CHSA) 的dsRNA (dsNlCHSA)，得到了dsNlCHSA/ROPE@C 纳米递送系统 (图3)。点滴法测定结果表明，dsNlCHSA/ROPE@C 可以使CHSA的相对表达量降低54.3%，BPH 的死亡率为65.8%。

图3 dsRNA/ROPE@C/APG 纳米递送系统示意图[98]Fig.3 Schematic diagram of dsRNA/ROPE@C/APG nano-formulation[98]

总的来说，CNPs 及其衍生物价格低廉、可生物降解、含量丰富、可大规模生产，是递送核酸农药的理想材料之一。然而，CNPs 及其衍生物提高RNAi 效率的能力似乎是特异性的，因此在纳入基于RNAi 的控制策略之前，需要对目标物种进行有效性测试[117]。

3.5.2.2 树枝状阳离子聚合物 树枝状阳离子聚合物是一类由重复单元组成超分支球状结构的阳离子聚合物。树枝状阳离子聚合物的内部也有大量叔胺基，这些叔胺基可以在酸性细胞内体中被质子化，从而启动“质子海绵效应”[63]。因此树枝状阳离子聚合物具有高负载率和高转染效率的特点。

中国农业大学沈杰团队在该领域做了许多工作，他们构建了一系列以酰亚胺衍生物为内核的核壳结构荧光阳离子纳米颗粒 (fluorescent nanoparticles，FNPs)，作为dsRNA 递送载体，表现出良好的靶标生物防治效果[99,118-120]。采用饲喂的方式，通过FNPs 递送几丁质酶基因CHT10的dsRNA 可以显著降低亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的体重，并导致幼虫脱皮缺陷和死亡[99]。为了更贴合实际应用，该团队后续开发了一种dsRNA/FNPs/表面活性剂的配方，只需要点滴在大豆蚜Aphis glycines4 龄幼虫的背板处，即可在1h 内穿透蚜虫角质层进入血腔，具有较高的基因沉默效应 (95.4%) 和良好的控制效果 (80.5%)[12]。然而，合成FNPs 的经济成本过高，这限制了其作为核酸农药递送载体走向田间大规模应用。基于此，该团队设计了一种低成本、低细胞毒性、高基因转染效果的星形阳离子聚合物 (SPc) 纳米材料(100.5 nm，+20.9 mV) (图4)[121]。该材料以商业化成本低廉的季戊四醇为原材料，不仅简化了合成步骤，而且减少了有机溶剂的使用，在核酸农药纳米递送系统领域具有巨大的应用潜力。Yang等[100]利用SPc 与可以抑制植物侧根发育基因的双链微小RNA (microRNA，miRNA) 组装形成纳米复合物 (253.6 nm ± 5.0 nm，+14.03 mV) ds-miRNA/SPc，处理拟南芥Arabidopsis thaliana幼苗后的表型与过表达miRNA 的转基因拟南芥相似。Yan 等[11]将针对ATP 酶 (V-ATPaseD) 和几丁质合酶 (CHS1)基因的dsRNA/SPc 制剂 (沉默效率为86.86%～58.87%) 直接喷洒在大豆幼苗上，大豆蚜取食后其死亡率可达78.5%。最近的研究发现，采用CNP/SPc 复合物 (CNP/SPc complex，CSC) 作为dsRNA纳米载体，以真核RNAi 机制的核心组件Argonaute蛋白 (AGO) 为靶基因，在水稻表面喷洒dsAGO/CSC复合物，能够将水稻叶片上立枯丝核菌Rhizoctonia solani的病变面积减少92%，且持效期长达20 d[101]。然而，最近Yan 等[122]研究表明，SPc 材料本身对模式生物黑腹果蝇具有生物毒性，除对成虫具有急性毒性外，SPc 对新生幼虫的寿命、生育能力、攀爬能力和抗逆性也产生了不利影响。

图4 基于SPc 的核酸农药递送系统用于害虫防治[121]Fig.4 SPc as a highly efficient gene vector in pest management[121]

总的来说，SPc 材料作为核酸农药载体具有巨大的应用潜力，但应继续优化和开发新的配方，提高对非靶标生物的特异性，以降低环境安全与人类健康的风险[117]。

3.5.2.3 胍类聚合物 胍类聚合物 (guanidinecontaining polymers，GCPs) 是一类分子链中存在胍基基团的聚合物。科学研究表明，dsRNA/siRNA对碱性环境非常敏感，在强碱性环境下易被水解[53]，而鳞翅目害虫的肠道微环境为碱性，pH 值甚至可以达到12.0，这可能是鳞翅目昆虫RNAi技术的最大挑战[123]。胍基是碱性最强的有机碱[124]，可以在高范围碱性pH 环境中保持正电性，含有胍基的GCPs 可以与dsRNA/siRNA 结合并在强碱环境中保持稳定。基于此，GCPs 材料或许可以为鳞翅目害虫的RNAi 提供新的途径。例如，Christiaens等[58]合成了一种含有胍基的阳离子聚甲基丙烯酸酯聚合物 (PAG87L)，研究表明，PAG87L 可以保护dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua肠液 (pH =11.0) 中避免降解超过30 h，而裸dsRNA 仅10 min就完全降解；以几丁质合酶B 基因 (ChSB) 为靶标基因，饲喂dsChSB/PAG8L7 复合物的甜菜夜蛾死亡率约为53.3%，饲喂对照裸dsChSB的死亡率仅为16.7%。Parsons 等[102]合成了另一种GCPs 材料——聚-N-(3-胍基丙基) 甲基丙烯酰胺 (poly-[N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide]，PGPMA) 负载斜纹夜蛾CDC27基因的dsRNA，与Sf9 细胞体外孵育48 h 后，Sf9 细胞中该基因的mRNA 水平减少了92%。用dsCDC27/PGPMA 复合物连续饲喂斜纹夜蛾3 龄幼虫7 d，29 d 后死亡率约为30%。

3.5.3 多肽纳米材料 多肽是一类由多个氨基酸通过肽键共价连接的化合物。基于天然多肽的纳米载体通常具有安全无毒、可生物降解等特点，已成为核酸农药载体材料的研究热点之一。

3.5.3.1 支链两亲性肽胶囊 支链两亲性肽胶囊(branched amphiphilic peptide capsules，BAPCs) 是由两亲性氨基酸自组装成双层分隔的超分子纳米囊泡，具有与脂质体类似但更加稳定的结构。Avila等[56]在赤拟谷盗和豌豆蚜的饲料中分别加入靶向内质网未折叠蛋白反应信号通路基因 (BiP和Armet)的dsRNA/BAPCs 复合物，可以显著抑制靶标基因的表达，从而影响内质网蛋白质折叠，若同时饲喂BiP-dsRNA 和Armet-dsRNA 与BAPCs 的复合物可导致赤拟谷盗3 龄幼虫75%的死亡率。此外，与单独喂食裸BiP-dsRNA 相比，喂食BiP-dsRNA/BAPCs 复合物的豌豆蚜可提前6～9 d 死亡。该项研究表明，BAPCs 纳米材料增强了口服dsRNA 的给药效果并改善了RNAi 效应。Wessel 等[125]最近的一项研究证明了BAPCs 可被一种常见的土壤真菌构巢曲霉Aspergillus nidulans降解，从而减少了这些纳米颗粒对环境的潜在影响。目前，口服BAPCs 对其他害虫中产生RNAi 效应的潜力仍需进一步的研究证明[117]。

3.5.3.2 细胞膜穿透肽 细胞膜穿透肽 (cellmembrane penetrating peptides，CPPs) 是一种具有穿透生物膜系统功能的短肽的统称。CPPs 可以作为siRNA、蛋白质、附加肽和其他生物小分子的载体，增加细胞对dsRNA 的摄取并协助其在细胞内的内体逃逸[126-127]。在CPP 家族中，富含精氨酸的Tat 肽 (AYGRKKRRQRRR) 已被证明可以在昆虫细胞中成功地内化质粒DNA 和激素[128-129]。肽蛋白转导结构域 (peptide transduction domain，PTD) 是Tat 肽的一个改进型小分子多肽。该结构域包括血凝素肽的脂质融合特性，它可以在胞吞作用后破坏囊泡膜，将装载的生物分子分散到细胞质中[130]。通过将PTD 与dsRNA 结合域 (dsRNA binding domain，DRBD) 配对结合，可以形成核糖核蛋白颗粒 (ribonucleoprotein particles，RNPs) 来携带dsRNA 穿过细胞膜，逃离内体，并诱导沉默[103]。Gillet 等[103]发现，RNPs 可以增强dsRNA在酸性条件下的耐受性和提高dsRNA 在Sf21 细胞中的体外转染效率。饲喂棉铃象甲Anthonomus grandis靶向几丁质合酶II (Ag-ChSII) 基因的RNPs可以降低Ag-ChSII基因80%的转录水平，显著高于裸dsRNA 处理 (30%) (图5)。该研究证明了CPPs递送dsRNA 到昆虫细胞的细胞质方面的实用性，但目前未见有关CPPs 介导的核酸农药递送系统在其他害虫中应用的报道。

图5 dsRNA 与PTD-DRBD 联合口服传递的机制模型[103]Fig.5 Model for the mechanism of oral delivery of dsRNA combined with PTD-DRBD[103]

3.5.4 碳基纳米材料 碳基纳米材料是指具有独特结构和性质的碳材料。已有研究表明，碳基纳米材料在递送核酸分子方面表现出良好的基因转染效率，与商业脂质体2000 相比具有较低的细胞毒性[131]。此外，碳基纳米材料的合成成本廉价且技术成熟，易被多功能化修饰[132]。这些特性使得碳基纳米材料成为一种新兴的核酸传递工具，在核酸农药纳米递送系统领域具有巨大的应用前景。

3.5.4.1 碳纳米管 碳纳米管 (carbon nanotubes，CNTs) 是一种由碳原子组成的管状中空纳米材料，主要包括单壁碳纳米管 (single wall carbon nanotubes，SWNTs) 和多壁碳纳米管 (multiwalled carbon nanotubes，MWNTs)。由于其疏水性的特点，CNTs 的生物相容性较差，实际应用中通常需要对其进行功能化或表面修饰。2009 年，CNTs首次被报道用作植物基因传递载体，该研究将氧化的SWNTs 与单链DNA 结合，发现该复合物可以在不使用基因枪的情况下穿透细胞壁和细胞膜[133]。虽然该研究证明了CNTs 可以递送DNA 进入有壁细胞，但SWNTs 在植物细胞中的内化机制尚未得到详细研究。除了SWNTs 外，MWNTs 也被证明具有穿透植物细胞的能力。Serag 等[134]利用透射电镜和共聚焦成像技术阐明了MWNTs 进入植物原生质体的内化机制，研究结果表明，植物原生质体对MWNTs 的摄取是通过胞吞-内体逃逸模式完成的。随后的研究也报道了CNTs 携带其他核酸分子进入植物细胞的能力，例如质粒DNA[135]、dsRNA[104]和siRNA[136]。Demirer 等[136]研究表明，SWNTs 介导的siRNA 传递可以在mRNA水平上达到95%的基因沉默效率，显著减少核酸酶对siRNA 的降解作用。Edwards 等[104]采用聚酰胺树状分子 (PAMAM) 对CNTs 进行表面修饰得到PAMAM-CNTs 颗粒，相较于注射裸dsRNA，向赤拟谷盗幼虫体内注射PAMAM-CNTs-dsRNA复合物可以显著提高对靶标基因的沉默效率；然而，注射高剂量的 PAMAM-CNTs 颗粒(200 μg/mL)在60 h 后对赤拟谷盗4 龄幼虫产生了明显的生物毒性。因此，对于未来的研究，需要对CNTs 本身的毒性和在生物体内的降解进行长期评估，以充分证明CNTs作为核酸农药载体在农业中的安全使用。

3.5.4.2 碳量子点 碳量子点也称碳点 (carbon dots，CDs)，通常被定义为具有显著荧光性能，粒径小于10 nm 的球形碳颗粒，是一种新兴的碳纳米功能材料。CDs 具有可光致发光性、高分散性、低毒性、生物相容性、生物降解性、原材料来源广泛和低成本等优点，目前被广泛应用在生物成像、癌症治疗、光电子器件、催化、功能材料和农业等领域[137]。与CNTs 相似，运用CDs 递送核酸分子时通常需要对其进行表面修饰。Schwartz等[105]采用PEI 修饰的CD 材料 (CD-PEI，～3.9 nm)装载编码镁螯合酶 (一种植物叶绿素合成必需酶)两个亚基 (CHLH和CHLI) 基因的siRNA，通过喷洒的方式处理模式生物本氏烟草Nicotiana benthamiana的叶面，发现siRNA/CD-PEI 复合物表现出良好的沉默效率，可以抑制CHLH基因79%的转录水平。Das 等[138]通过饲喂法评估了CNP、CDPEI 和胺功能化二氧化硅3 种纳米材料递送埃及伊蚊关键生长发育基因 (SNF7和SRC) dsRNA 后触发的沉默效率，结果表明，CD-PEI 是保护和传递dsRNA 最有效的载体，具有更高的沉默效率和死亡率。最近，中国农业大学刘西莉团队制备了一种聚乙二醇异丙烯酸酯 (poly (ethylene glycol)diamine，PEGDA) 修饰的CDs (CDs 平均粒径为2.6 nm) (图6)，装载靶向卵菌保守并且是两类杀菌剂靶标蛋白的纤维素合酶基因 (CesA3) 和氧化固醇结合蛋白基因 (OSBP1) 的dsRNA，生物活性测定发现，核酸农药纳米递送系统CesA3-/OSBP1-dsRNA-CDs 对致病疫霉Phytophthora infestans、大豆疫霉Phytophthora sojae和辣椒疫霉Phytophthora capsici均表现出良好的防治效果[106]。此外，同时喷洒dsRNA-CDs 与作用靶标相同的化学杀菌剂，在保证防效的同时可以减少90%化学药剂的使用，这对农药的减施增效具有重要意义[106]。

图6 基于碳量子点递送dsRNA 来控制植物疫霉菌的可喷洒核酸农药模型[106]Fig.6 Working model of SIGS dependent on carbon dot delivered dsRNAs to control Phytophthora diseases[106]

3.5.5 层状双氢氧化物 层状双氢氧化物 (layered double hydroxides，LDHs) 是一种类似天然水滑石的二维离子层状纳米颗粒，由带正电荷的层板与层间阴离子组成。LDHs 的一般组成公式为[M2+(1-x)M3+x(OH)2]x+An-x/n·zH2O，其中M2+和M3+为二价和三价金属离子，An-为层间电荷平衡阴离子。大量研究表明，LDHs 具有多用途特性，可以作为一种生物相容性、低毒性的基因和药物载体[139]。LDHs 进入植物细胞的方式包括自由扩散和胞吞两种[140]。由于存在植物细胞壁孔径大小的限制，粒径成为LDHs 纳米颗粒在植物细胞中成功内化的关键因素。例如，Yong 等[107]发现，在50～120 nm 的粒径范围内，粒径为50 nm 的LDH纳米颗粒在番茄Solanum lycopersicum花粉细胞中表现出最快的内化速率，递送dsRNA 至转基因番茄10512i 的花粉细胞中可以造成GUS (β-glucuronidase) 报告基因的mRNA 水平下降89%，显著高于相同剂量的单独dsRNA 处理 (37%)。

澳大利亚昆士兰大学Neena Mitter 与许志平合作开发了一种基于LDHs 的RNA 农药喷雾制剂——LDH-dsRNA (BioClay)，以辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒 (cucumber mosaic virus，CMV) 特异性基因为靶基因，仅叶面喷洒一次BioClay 就可以为豇豆Vigna unguiculata提供长达20 d 的有效病毒防护，30 d 后仍可以检测到叶片表面的dsRNA[25]。近年来，该团队利用高通量RNAi 手段筛选到烟粉虱Bemisia tabaci的致死基因，叶面喷施BioClay 在烟粉虱整个生命阶段 (卵、若虫、成虫) 都有良好的控制效果 (图7)[24]。此外，LDH纳米颗粒在湿润的CO2环境下就可以降解，并且在哺乳动物中无毒性[25,139]。综上所述，LDHs 纳米材料在核酸农药纳米递送系统领域具有巨大的应用前景，其在进入植物细胞后的系统保护机制仍需进一步研究。

图7 叶面喷施BioClay 可防治整个生命阶段烟粉虱 (卵、若虫、成虫) [24]Fig.7 Foliar-applied dsRNA-LDH (BioClay) provides safe and effective planta protection from whitefly eggs, nymphs, and adults[24]

4 核酸农药纳米递送系统的安全风险

农药的使用与食品安全和人类健康息息相关。核酸农药纳米递送系统作为一项新技术，其在实际应用中的安全性问题受到普遍关注。

RNAi 的脱靶效应是核酸农药应用中备受关注的问题，这种效应可能是由于dsRNA 序列和脱靶基因的mRNA 序列之间存在足够的相似性引起的[46,141]。对于确保核酸农药纳米递送系统未来顺利进入市场，解决可能出现的脱靶效应风险尤为重要。因此，在设计RNAi 靶序列时，应该具有高度特异性，与脱靶转录本没有同源性和序列相似性，以减少或避免脱靶效应的发生。生物信息学工具和模型在设计RNAi 靶序列和预测潜在的脱靶效应方面具有十分重要的作用。随着众多物种基因组数据库的完善和各种生物信息学软件模型的开发，使得精确搜索、预测和设计特异性的dsRNA/siRNA 成为可能。例如，果蝇RNAi 筛选中心数据库 (http://www.flyrnai.org)、基因组RNAi数据库 (http://www.genomernai.org)、dsCheck 在线设计软件 (http://dscheck.rnai.jp)、Offtarget-Finder 在线工具 (https://www.specifly.org)、以及算法模型siRNA-Finder (https://github.com/snowformatics/siFi21)、pssRNAit SVM (https://www.zhaolab.org/pssRNAit) 和PFRED (https://github.com/pfred)。对于生物信息学预测设计的dsRNA/siRNA，仍需进一步对选定的试验物种类群进行饲养试验，以验证脱靶效应[142]。

纳米载体因其“纳米”特性可能会对环境安全和人类健康带来新的威胁。例如，碳纳米管具有致癌性，也会引起生殖和发育毒理学效应，同时在环境中难以降解[143]。肌凝蛋白作为真核生物的关键组成部分，壳聚糖纳米载体负载dsGFP或单独使用均可以显著抑制秀丽隐杆线虫虫体肌凝蛋白的表达[94]。SPc 纳米载体自身对非靶标生物黑腹果蝇具有急性毒性，且对其初孵幼虫的寿命、生育能力、攀爬能力和抗逆性均产生了不利影响[122]。因此，需要对纳米载体材料进行严格的安全性评估，分析其潜在风险。

5 总结与展望

基于RNAi 技术的核酸农药在有害生物防治领域具有巨大的潜力，使用核酸农药控制病虫害将为有害生物综合治理增加新的维度。核酸农药目前已经有产业化的案例。相对于转基因植物核酸农药，可喷洒核酸农药不需要通过转基因植物就可以提供针对有害生物的基因控制，因而更具吸引力，其商业化更易被接受。纳米科技的发展为可喷洒核酸农药的发展提供了新的思路，各种具有特殊物化性质和生物学功能的纳米材料已成功应用于核酸农药的递送。基于纳米材料为载体的核酸农药纳米递送系统可以提高核酸农药在环境中的稳定性和有效促进其在目标生物细胞内的扩散、摄取和内体逃逸，对于核酸农药的高效应用和有害生物绿色防控具有重要意义。

然而，核酸农药纳米递送系统的广泛应用仍受部分因素限制：

1) 靶标基因。如何获得高效、特异致死的靶标基因dsRNA 序列是核酸农药纳米递送系统的首要因素[144]。理想的靶标基因可以利用低剂量的dsRNA 引起高效的RNAi 效应，靶基因的筛选和挖掘是一项费时费力的工作，需要更多的研发投入。

2) 生产成本。开发一类合成简单、价格低廉的纳米载体以及研发一种可大量、低成本、高效合成dsRNA 的技术，是核酸农药走向田间大规模应用的前提。中国农业大学沈杰研究团队和美国RNAGri 公司在这方面已有创新性技术[121,145-146]，未来仍需继续开发多元的技术手段，降低生产成本，促进核酸农药纳米递送系统的大规模生产。

3) 潜在环境、健康风险。目前基于纳米材料递送核酸农药的新型核酸递送系统重点关注在纳米递送系统的制备、物理表征、生物活性等方面，缺乏关于潜在的脱靶效应以及纳米材料在环境中的命运以及沿食物链的潜在生物积累等信息。因此，必须对未来的研究建立一个可靠检验模型，以确定在农业中使用纳米材料及核酸农药相关产品的风险。

近年来，随着RNAi 医药研发的蓬勃发展和相关技术的不断突破，基于RNAi 技术的核酸农药研发也进入了快速发展的时期[6]。核酸农药纳米递送系统在核酸农药递送领域展现出很多独特的优势，特别是能够对dsRNA 提供高效保护以及大幅提升核酸农药的RNAi 效率，关注和推动新型核酸农药纳米递送系统的研发将对我国绿色农业和生态农业的发展具有重要意义。此外，未来多学科的研究者应加强交流合作，阐明植物和纳米材料之间相互作用的问题，加强纳米载体的生物安全性评估研究，优化载体设计以减少潜在毒性，这对促进核酸农药纳米递送系统的大规模应用具有重要指导意义。