顶空固相微萃取结合气相色谱质谱法分析不同品种香水莲花的香气成分

邓琳玥，罗丽霞，高 杰，苏忠书，张昭其，黄雪梅，方 方，林文洪

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.珠海市现代农业发展中心，广东 珠海 519000）

【研究意义】香水莲花（Nymphaeahybrid）是睡莲科睡莲属、花有香气的睡莲统称，为多年生水生宿根草本植物，素有“水生植物皇后”之称，是重要的观赏型水生花卉和世界名花之一，广泛分布于热带和温带地区［1］。香水莲花花色丰富，花香浓郁，观赏价值极高，深受人们喜爱，是芳香类植物的优良种质资源［2］。此外，香水莲花花朵富含氨基酸和矿质元素等，在食品和茶饮中具有广泛的应用价值，是制作保健品、化妆品的重要原料。香水莲花茶香气宜人，以香水莲花浸酒也具有清新独特的风味［3］。香气是评价香水莲花鲜切花及其加工品的重要品质指标。香气对花卉品质的影响较大，尤其是特征香气物质对其品质的影响更为关键。【前人研究进展】顶空固相微萃取结合气相色谱质谱法（HS-SPME/GCMS）是目前检测挥发性成分最常用的技术，该技术在柚子［4］、茶花［5］、陈皮［6］等挥发性成分检测中广泛应用。国内外学者已经从少量睡莲品种中鉴定出一些挥发性化合物成分。徐辉等［7］分别从红色、紫罗兰色的香水莲花中提取挥发油，通过GC-MS 分析共鉴定出37 种香气成分，主要成分为苄醇、6,9-十七碳二烯、8-十七碳烯、2-十七酮、正十五烷烃等。Maia 等［8］测定了6 种睡莲属植物的挥发性成分，共鉴定出22 种挥发性物质，其中脂肪族9 种、萜类5 种和芳香族8 种，检测到己酸甲酯、苯甲醇和苄基甲醚等。袁茹玉［9］对56 个睡莲栽培品种进行挥发性成分分析，发现在耐寒睡莲中醇类、醛类和酮类物质是香气的主要成分，含有橙花叔醇和丁香花醇；在热带睡莲中，酯类、醇类、萜类、醛类和酮类化合物是香气的主要成分，含有苯甲酸乙酯、3-（1,5-二甲基-4-己烯基）-6-亚甲基环己烯、乙酸苯酯和2-十五碳酮等。Jiang 等［10］认为日间开花睡莲的挥发性化合物主要为单/倍半萜、脂肪酸衍生物和苯丙烷类，夜间开花睡莲的挥发性化合物主要是二萜、脂肪酸衍生物和苯丙烷类。前人虽已对少数睡莲品种的挥发性物质进行鉴定分析，但不同品种睡莲挥发性物质的种类与含量各不相同，使得其具有特征的香气品质。目前关于香水莲花的挥发性化合物香气活力值分析较少，特征香气物质也未有定论。【本研究切入点】我国香水莲花种质资源众多，随着种植面积不断扩大，深入探析香水莲花的香气品质以开发高品质加工品迫在眉睫。香水莲花香气独特，品种之间香气差异较大，挥发性成分相关的研究与利用却少有报道；香气物质种类繁多，代谢机制复杂，严重制约了香气化合物合成的机理研究。国内外对香水莲花的香气成分研究尚不多见，尤其缺乏对不同品种香水莲花特征香气物质的分析。【拟解决的关键问题】本研究选用的4 个不同花色香水莲花花香浓郁、花色典雅，作为鲜切花和花茶具有良好前景。通过对香气成分的分析有助于了解其香气品质，为香水莲花香气物质合成及其调控提供科学依据。本研究采用HS-SPME-GC-MS 法鉴定香水莲花的挥发性成分种类和含量，对主要的呈香挥发性化合物进行定性、定量分析，以期更好地对香水莲花的品质进行评价，为将来选育香气优良品种和开发高品质加工品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的4个不同花色（白花、黄花、粉花、紫花）香水莲花品种（图1），采自广东省珠海市金湾区平沙镇台创园香水莲花种质资源圃。在晴朗无风的早上（8：00—9：00，26 ℃左右），采摘4个品种的莲花，用于花香物质的测试与分析。

图1 4 个不同花色香水莲花品种的外观Fig.1 Appearance of four Nymphaea hybrid varieties with different colors

测试所用试剂为癸酸乙酯；HS-SPME 分析，采用PDMS/DVB-65 μm（PDMS/DVB）萃取纤维（Supelco Inc.,Bellefonte,USA）；GC-MS 分析，采用Agilent 7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪（Agilent,USA）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 选取新鲜、无损坏、无氧化的花瓣，用镊子将其从花上轻轻摘下，放入洁净的玻璃瓶中备用。

1.2.2 仪器条件（1）顶空固相微萃取条件：精确称取2 g 新鲜花瓣样品置于40 mL 顶空瓶中，密封，采用顶空固相微萃法进样。采用SPME PDMS/DVB-65 μm，设置老化温度250 ℃，萃取前老化时间30 min，吸附温度45 ℃，吸附时间50 min，进样口温度250 ℃，解吸时间3 min。

（2）气相色谱条件：色谱柱为HP-5ms Ultra Inert（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；柱温程序：初始温度40 ℃、保持2 min，然后以4 ℃/min升温至110 ℃、保持2 min，再以3 ℃/min 升温至150 ℃、保持2 min，最后以5 ℃/min 升温至200 ℃、保持4 min；柱流量1 mL/min；载气为高纯氦气（He）；进样方式为不分流进样；溶剂延迟时间为10 min。

（3）质谱条件：EI 电离源，离子源温度为230 ℃，电子能量70 eV；四极杆温度和接口温度为150 ℃；全扫描模式，扫描范围m/z 为33～450。

1.2.3 挥发性物质鉴定 分析所测总离子流图中各峰，经计算机数据系统检索对比Nist2017s 标准质谱图，通过检索相似度匹配值确定其挥发性物质的化学成分，用峰面积内标法计算各化学成分的相对含量，试验3 次重复。使用内标法进行香气成分定量分析，计算公式为：

式中，A为香气成分相对含量（μg/g），b1为各香气成分峰面积，b2为内标物峰面积，c1为样品质量（g），c2为内标物质量（μg）。

1.2.4 香气活力值（OAV）分析 OAV 的计算公式为：V=Ci/OTi式中，V为香气活力值，Ci为某种香气成分的相对含量（μg/kg），OTi为某种香气成分在水中的阈值（μg/kg）。各物质香气阈值查阅文献［11-12］得到。

运用Microsoft Excel 2016、SPSS 27.0 及Origin 2019 软件对试验数据进行整理、统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种香水莲花的挥发性物质定性与定量分析

采用HS-SPME/GC-MS 技术对4 个不同花色香水莲花品种的挥发性物质进行检测。挥发性成分总离子图如图2 所示。采用内标法计算各积分色谱峰占总峰面积的百分比，得到不同品种香水莲花挥发性物质的种类和相对含量。从4 个品种香水莲花中共检测到挥发性物质127 种，主要分为烃类、酮类、醇类、醛类、酯类、酸类、萜类和其他共八大类化合物。其中，萜类数量最多，共34 种，占检出总数的26.8%；其次是烃类，为31 种，占比24.4%；醇类、酮类、醛类和酯类分别为7 种、8 种、8 种和21 种，分别占比5.5%、6.3%、6.3%和16.5%；酸类、酚类和醚类各3 种，均占比2.4%；其他化合物检测出12 种，占比9.4%（图3A）。

图2 顶空固相微萃取香水莲花的挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of volatile components in Nymphaea hybrid by HS-SPEM

图3 顶空固相微萃取香水莲花的挥发性成分总分类图（A）和各类成分的相对含量（B）Fig.3 General classification chart of volatile components (A) and relative contents of various types of components (B)in Nymphaea hybrid by HS-SPEM

在挥发性物质总含量中（图3B），烃类化合物总含量最高，为169.41 μg/g，占总挥发物含量的52.22%；其次是萜类，含量为76.67 μg/g，占 比23.63%；醇类含量为40.31 μg/g，占 比12.42%；另外，酯类的数量较多，但是含量仅占4.48%。烃类、萜类、醇类及酯类是香水莲花的主要挥发性组分。其中有香气的化合物共45 种，主要的香气成分以萜烯类化合物为主，其次为酯类化合物。各类主要香气物质相对含量见表1。

表1 不同品种香水莲花的主要香气物质相对含量Table 1 Relative contents of major aroma compounds in different varieties of Nymphaea hybrid

由表1 可知，在白色香水莲花中检测到含量最多的物质为6,9-十七碳二烯、正十五烷烃、8-十七烯、苯甲醇、(E)-佛手柑烯；在黄色香水莲花中检测到含量最多的物质为正十五烷烃、6,9-十七碳二烯、苯甲醇、乙酸苄酯、8-十七烯；在粉色香水莲花中检测到含量最多的物质为苯甲醇、6,9-十七碳二烯、正十五烷烃、8-十七烯、β-倍半水芹烯；在紫色香水莲花中检测到含量最多的物质为正十五烷烃、6,9-十七碳二烯、苯甲醇、β-倍半水芹烯、反式-α-佛手柑烯。在4 个品种香水莲花中，含量最多的5 种物质中香气物质只占2～3 种；不同品种香水莲花含量最多的香气物质均不相同且含量差别较大。在紫色香水莲花睡莲中，正十五烷烃的含量为41.88 μg/g，是其他花色的数倍以上；而共同具有的香气物质为苯甲醇，在黄色、紫色香水莲花中的含量均接近14 μg/g，而在粉色、白色香水莲花中则仅含7.77、3.64 μg/g。可见4 个品种香水莲花的挥发性物质含量具有较大差异。

2.2 不同品种香水莲花的挥发性物质分类比较

对不同品种香水莲花的挥发性物质按结构分类，各类别化合物数量的分布如图4 所示。

图4 不同品种香水莲花的挥发性物质种类及其所含化合物数量Fig.4 Types of volatile compounds and the quantity of compounds contained in different varieties of Nymphaea hybrid

萜类化合物是香水莲花香气的主要成分。从4 个品种中分别鉴定出24、19、22、22 种萜类化合物，其中金合欢烯、反式-α-佛手柑烯和β-倍半水芹烯等物质的量最高。白色香水莲花的萜类物质数量最多，且与黄色香水莲花有极显著差异。4 个品种的挥发性物质萜类的组成差异主要体现在一些香气阈值较低的物质上，如β-倍半水芹烯在紫色香水莲花中含量可达12.57 μg/g，是其他花色香水莲花的6～16 倍。

在烃类物质中，6,9-十七碳二烯和正十五烷烃在4 个花色中均较高；其他共有物质包括十六烷、十三烷、十七烷等。紫色香水莲花的特有烃类较多，包括环十五烷烃、1,3-环辛二烯和7-十四碳烯等，这几个物质均未在其他花色中发现。白色与粉色香水莲花在物质数量上无显著性差异，与黄色、紫色香水莲花的差异较大。

醇、酮类中大部分物质含量较小且不具有香味，仅有苯甲醇含量较高，具有微弱的芳香气味。粉色香水莲花含有醇、酮类物质的数量与其他3个花色品种有较大差异。

酯类化合物大多具有不同水果香，阈值较低，是除萜类外第二大香味形成的组分。粉色香水莲花含有的酯类数量最多，显著高于其他花色。4个品种共有的酯类化合物仅包含苯甲酸乙酯、乙酸苄酯和邻苯二甲酸异丁基辛酯。而酸类化合物含量和种类较少，推测其不是香水莲花的主要呈香物质。

酚和醚类化合物在4 个品种香水莲花中的种类和含量均不高。在醛类化合物中，大部分不具有香气，仅有苯甲醛含量较高且具有香气。此外，分别在白色、黄色、粉色、紫色香水莲花中检出5、3、3、7 种其他类别物质。

在各类挥发性物质中，烃类物质总量最多，特别是十五烷、十七烷和6,9-十七碳二烯总浓度高，与前人所报道的相似［13］，但是这类物质大部分成分均不具有香气。酯类和萜类物质为香水莲花香气的主要贡献物质。

2.3 不同品种香水莲花的挥发性代谢组多元统计分析

通过韦恩图（图5A）分析发现，31 种化合物为4 个品种香水莲花所共有，包括10 种烃类、3 种酮类、2 种醇类、2 种醛类、3 种酯类、10 种萜类和其他物质1 种。不同种质所特有的挥发性物质有64 种，其中白色香水莲花含有12 种，分别为(E,Z)-4,6,8-麦角三烯、Z-5-壬癸烯、9,12,15-十八烯-1-醇、2-十八碳-9,12-二烯氧乙醇、Z,Z-3,13-十八烯-1-醇、十五醛、乙酸-三氟-十一碳酯、2,6-二甲基辛酸甲酯、17-五萜、倍半柳烯、1,2:7,8-二苯并咔唑、9-甲基双环［3.3.1］壬烷；黄色香水莲花含有20 种，分别为植烷、1-十三烯、反式环癸烯、9-甲基十九烷、1,19-二十碳二烯、3,4-辛二烯、2-十四酮、2-十六酮、4-甲氧基苯甲醛、十六醛、二十醛、11-十四烷-1-醇-乙酸酯、邻苯二甲酸、3-甲基丁基壬酯、邻苯二甲酸、3-甲基丁基-3-烯丙基异丁酯、亚麻油酸、2,6-二叔丁基对甲酚、7,9-十三碳烯丙基甲基醚、α-帕楚伦、环十二炔、(1R,5R)-4-亚甲基-1-((R)-6-甲基庚-5-烯-2-基)双环己烷；粉色香水莲花含有11种，分别为顺式双环［10.8.0］二十烷、异十六烷、1,2-二甲基-环辛烯、2-十七碳烯醛、甲酸香茅酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸二酸-2-异丁基酯、反式金合欢醇、1,2,4-三甲基苯；紫色香水莲花含有19 种，分别为环十五烷烃、四甲基三环-十一碳九烯、1,3-环辛二烯、1-十九烯、9-十九烯、7-十四碳烯、2-十五酮、2-乙基环己酮、1,2,5-三甲基-4-哌啶酮、2-己基-1-癸醇、2-氟苯甲醚、角鲨烯、β-红没药烯、β-柏木烯、4-萜烯醇、1,3-二乙基-4-甲基苯、2-癸氧乙烷、六甲基-环庚三烯、2,5-环己二烯-1,4-二乙基-二甲基。

图5 不同品种香水莲花挥发性化合物的花瓣韦恩图（A）、PCA 评分图（B）和主要成分聚类热图（C）Fig.5 Petal Wayne chart (A),PCA score chart (B) and cluster heat map (C) of volatile compounds of different varieties of Nymphaea hybrid

对4 个品种香水莲花的127 种挥发性物质进行主成分分析，结果（图5B）显示，PC1 占61.8%，PC2 占33.9%，表明种质间的物质存在明显差异。粉色和白色香水莲花分布在PC1 的负半轴上，且位置较近，说明这两个花色的挥发性物质相近；黄色和紫色香水莲花则分布在PC1 的正半轴上。

将40 种主要挥发性化合物含量绘制聚类热图，结果（图5C）显示，不同品种间存在明显的组间差异，图中深红色到深蓝色表示各种挥发性物质的含量高低。第Ⅰ类化合物为紫罗兰酮、金合欢烯等带有特殊香气的萜类，大部分在白色香水莲花中含量较高，其次为粉色香水莲花，而在黄色和紫色香水莲花中含量较低，代表这一类化合物是白色和粉色香水莲花的特征性香气物质。第Ⅱ类化合物大部分为带香气的酯类，在黄色香水莲花中含量最高，表明这可能是影响黄色香水莲花香型的重要化合物。第Ⅲ类化合物包含带香气的萜类和不带香气的烃类，在紫色香水莲花中含量最高。第Ⅳ类化合物大部分不带有香气，是黄色、白色、紫色香水莲花共有且含量较高的化合物。

2.4 不同品种香水莲花的挥发性物质OAV 分析

不同挥发性物质由于自身香气阈值及其浓度不同，导致它们对整体香气的贡献存在差异。通常将OAV＞1 的香气物质作为特征香气成分或主体香气成分［14］。利用文献记载的香气阈值计算各挥发性物质的OAV，并依据数据库［15］和文献资料［16-17］按各物质香气特征归纳不同品种香水莲花的香气特征，结果如表2 所示。

表2 不同品种香水莲花中主体香气物质的香气活力值和香气特征描述Table 2 Odor activity values and fragrance characteristics of principal aroma components in Nymphaea hybrid

推测香气成分含量高、阈值低的成分是香水莲花的特征香气成分。4 个品种香水莲花中共有18 个特征香气物质（表2），乙酸茴香酯、α-紫罗兰酮、红没药烯、反式-α-佛手柑烯、(E)-佛手柑烯等物质的OAV＞500，而β-紫罗兰酮、金合欢烯、β-倍半水芹烯、反式-β-金合欢烯的OAV＞10 000，说明这些物质对主体香气的贡献极大。同时，在白色香水莲花中，β-紫罗兰酮和(E)-佛手柑烯的OAV 值与其他花色有显著差别，其特征香气可能含有紫罗兰香和茶香；在黄色香水莲花中，乙酸苄酯和乙酸茴香酯OAV 值较高，对其香气贡献较大；粉色香水莲花中β-倍半水芹烯OAV 值最高；紫色香水莲花中α-紫罗兰酮和反式-α-佛手柑烯含量明显高于其他花色。

此外，4-萜烯醇OAV 值较高，但只在紫色香水莲花中检出，4-萜烯醇可能是紫色香水莲花所特有的，对主体香气贡献较大。乙酸茴香酯、亚麻酸、香叶基丙酮、(E)-佛手柑烯等也只在少数花色中检出；6-甲基-5-庚烯-2-酮在黄色香水莲花和紫色香水莲花中含量较高；乙酸苄酯在黄色香水莲花中含量特别高，是其他花色的5～40倍。上述几种物质可能是区分4 个花色的特征香气物质。

根据不同品种香水莲花所含特征香气物质的OAV 值分析，推测白色香水莲花的特征香气物质为苯甲酸乙酯、乙酸苄酯、乙酸茴香酯、α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、红没药烯、金合欢烯、反式-α-佛手柑烯、(E)-佛手柑烯、β-倍半水芹烯和反式-β-金合欢烯；黄色香水莲花的特征香气物质为苯甲醇、6-甲基-5-庚烯、苯甲醛、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯、乙酸茴香醛、亚麻酸、α-紫罗兰酮、红没药烯、金合欢烯、反式-α-佛手柑烯、β-倍半水芹烯和反式-β-金合欢烯；粉色香水莲花的特征香气物质为苯甲醇、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯、亚麻酸、α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮；紫色香水莲花的特征香气物质为苯甲醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯、4-萜烯醇、香叶基丙酮、α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、红没药烯、反式-α-佛手柑烯、β-倍半水芹烯和反式-β-金合欢烯。

通过表2 中挥发性物质所对应香气的描述词，可以将18 个特征香气物质归为柑橘香韵、花香韵、青草香韵、草本香韵、甜香韵和木香韵等6 种香气属性。根据香气物质的OAV 值可认为香水莲花的香气主要为花香韵和木香韵，而甜香韵和草本香韵占比较少。

3 讨论

香气是园艺花卉的的重要品质，近年来越来越受到重视。香气由多种挥发性化合物组成，作为重要的次生代谢产物赋予莲花独特的香气品质。本研究利用HS-SPME/GC-MS 方法从4 个品种香水莲花中共鉴定出127 种挥发性化合物，主要挥发性成分有6,9-十七碳二烯、正十五烷烃、苯甲醇等几种物质。其中，萜烯类的种类和相对含量均较高，还检测出几种具有香气的、新的萜类和酯类，如β-倍半水芹烯、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和乙酸茴香酯等。前人研究中报道较多的挥发性成分为6,9-十七碳二烯、苯甲醇、十五烷和金合欢烯等［10，18-21］，单萜和倍半萜的具体成分与含量不尽相同。不同研究中莲花挥发性物质存在差异，可能与供试的品种特性、环境因子和产地等因素有关。

本研究根据香气阈值、具体成分的含量，推算出相应的香气活力值OAV，推测几种相对含量较高、香气阈值较低的挥发性物质为香水莲花的特征香气物质，如金合欢烯、反式-α-佛手柑烯、(E)-佛手柑烯、α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、β-倍半水芹烯、γ-红没药烯、4-萜烯醇、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙酸苄酯、乙酸茴香酯、苯甲酸乙酯、苯甲醇、亚麻酸等。其中金合欢烯具有花香、青草和香脂香气［18］；反式-α-佛手柑烯和(E)-佛手柑烯具有木质香气和淡淡的茶香；α-紫罗兰酮具有似紫罗兰的花香，还有木香气息；二氢-β-紫罗兰酮呈木香和桂花花香，稍有龙涎和果香香韵；β-紫罗兰酮具有海藻、紫罗兰香［19］；β-倍半水芹烯具有木质香气；γ-红没药烯则具有木香、柑橘香、花香、果香、青香和甜润的香脂香气；4-萜烯醇呈胡椒香和木香；香叶基丙酮具有新鲜玫瑰叶、玉兰的花香和果香［20］；6-甲基-5-庚烯-2-酮具有柠檬草香气和清香；乙酸苄酯具有特殊的茉莉花香气［21］；乙酸茴香酯具有樱桃、葡萄的果香和依兰花香；苯甲酸乙酯具有清甜的花果样香气，有紫丁香、山楂花花香和轻微豆香；苯甲醇仅有微弱的芳香气味；亚麻酸则含有苦味。以上香气成分相互作用，构成了香水莲花特殊的香味。

4 结论

香水莲花香气浓郁，具有品种特色，通过HS-SPME/GC-MS 方法从4 个品种香水莲花的花瓣中共鉴定出挥发性物质127 种，其中有香气的化合物45 种。通过香气活力值分析，发现白色香水莲花的特征香气物质主要为乙酸茴香酯、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、红没药烯、金合欢烯、佛手柑烯、β-倍半水芹烯；黄色香水莲花的特征香气物质主要为乙酸苄酯、乙酸茴香醛、α-紫罗兰酮、金合欢烯、反式-α-佛手柑烯、β-倍半水芹烯；粉色香水莲花的特征香气物质主要为α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、金合欢烯、佛手柑烯、β-倍半水芹烯；紫色香水莲花的特征香气物质主要为α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、红没药烯、反式-α-佛手柑烯、β-倍半水芹烯。以上香气物质形成了橘香、花香、青香、草本香、甜香和木香等6 种主体香气属性，其中白色香水莲花的主体香韵为具有紫罗兰香韵的花香、草本香和木质香；黄色香水莲花的主体香韵为似紫丁香/茉莉的花香、木质香和油脂香；粉色香水莲花的主体香韵为桂花/海藻似的花香、草香和木质香；紫色香水莲花的主体香韵为温暖的木香、柑橘香、花香、果香、草本香和甜润的香脂香气。