基于网络药理学的仙茅-淫羊藿药对治疗卵巢早衰机制研究*

张欢欢，曾丽盈，李莉

1广州中医药大学，广东 广州 510006；2广州中医药大学第一附属医院

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁之前出现闭经，伴促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高，雌激素（estradiol，E2）水平降低，并伴有一定围绝经期症状。散发性POF在小于40岁女性中发生率为1%，小于30岁女性为0.1%，小于20岁女性为0.01%［1-3］。其病因及发病机制尚未明确。西医治疗大多选用激素替代疗法，远期疗效不佳且有相关风险。中医无“卵巢早衰”病名，按照其发病特点及临床表现，可归于“血枯”“闭经”“妇人脏躁”等范畴。

中医认为肾藏精、主生殖，肾中精气的盛衰与“肾-天癸-冲任-胞宫轴”的功能状态密切相关，肾精气亏虚、天癸早竭是本病的主要病机。治疗应以补肾填精为法，多项临床研究表明二仙汤及仙茅-淫羊藿药对能有效治疗POF，曾活等［4］研究认为二仙汤治疗POF较常规西药治疗更具优势，能够改善患者临床症状，调节其内分泌激素，而仙茅、淫羊藿两者为此方君药。仙茅为石蒜科多年生草本植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn的干燥根茎，具有补肾助阳、补益精血、强壮筋骨、行血消肿功效，主要用于肾阳不足、虚劳内伤和阳虚冷泻等病症［5］。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿E.brevicornumMaxim.的全草，味辛、甘，具有补肾阳、祛风湿、强筋骨功效［6］。由于中药及其复方并非由单一药物、单一成分组成，其具有“多成分、多途径、多靶点”的协同作用特点，疗效往往取决于其中有效成分的综合作用。但目前药理研究大多分析了单药成分作用机制，而本研究利用网络药理学方法有助于进一步探讨仙茅-淫羊藿药对治疗POF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 POF疾病靶点的获取以关键词“Premature ovarian failure”在人类基因组注释数据库Gene Cards（https：//www.genecards.org）和Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）两个疾病靶点筛选数据库检索获取与POF相关靶标基因，合并所获得的数据，去除重复数据。

1.2 仙茅与淫羊藿化学成分和成分靶点信息获取使用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）及数据库（version 2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平台，设定药物成分口服生物利用度（oral bioavailability，OB≥30%）和 类 药 性（drug-likeness，DL≥0.18）分析筛选出仙茅、淫羊藿中具有良好OB和DL的化合物及其靶点。将TCMSP筛选出的成分靶点全称输入DrugBank和UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）获取基因简称和Uniprot ID。

1.3 共同靶点获取使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics（http：//bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）匹配映射药物成分相关靶点，绘制维恩图获得仙茅-淫羊藿活性成分治疗POF的潜在作用靶点。

1.4 药物-活性成分-共同靶点-疾病网络构建使用Cytoscape软件（Version 3.6.2，http：//www.cytoscape.org）构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”关系网络。节点（node）代表疾病（POF）、仙茅（XM）-淫羊藿（XLP）药种、药物活性成分与疾病关键靶点基因；边（edge）用来连接单味药与活性成分、活性成分与疾病关键靶点基因、疾病与其对应的关键靶点基因。整个网络展示药物-活性成分-共同靶点-疾病之间的联系。

1.5 关键靶点蛋白相关作用网络构建通过STRING数据库（https：//string-db.org/）获得PPI蛋白互作图，通过Cytospace软件制作hub图。

1.6 基因本体论富集分析（gene ontology,GO）与KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析使用DAVID数据库功能注释工具（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）对获取的关键靶点进行GO与KEGG通路富集分析，选择P＜0.05结果分析仙茅-淫羊藿药对发挥药理作用的主要生物过程及信号通路，并利用ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）平台以气泡图的形式呈现。

2 结果

2.1 POF疾病靶点基于GeneCards，Drugbank数据库收集POF相关靶点基因，删除重复靶点后，共收集到POF疾病作用靶点3254个，得到的靶点信息进行基因名和Uniprot ID的标准化。

2.2 仙茅-淫羊藿活性成分通过TCMSP数据库以OB≥30%和DL≥0.18为条件检索的仙茅潜在活性成分7个，淫羊藿潜在活性成分23个，见表1。

表1 仙茅-仙灵脾中潜在活性成分及其OB、DL值

2.3 仙茅-淫羊藿成分治疗POF的潜在作用靶点通过TCMSP数据库检索仙茅-淫羊藿符合条件的潜在活性成分及其靶点，去重后，得到仙茅活性成分作用靶点61个，淫羊藿活性成分靶点217个。使用Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平台将药物潜在作用靶点基因同疾病基因进行匹配并绘制维恩图，获得共同基因41个，见表2。

2.4 药物-活性成分-共同靶点-疾病网络构建将仙茅、淫羊藿两味药物与POF的共同靶点及其对应的化合物导入Cytoscape软件构建药物-活性成分-共同靶点-疾病网络。网络共包含74个节点，667条边。仙茅-淫羊藿30个活性成分直接与关键靶点基因相连的有26个。见图1—2。

图1 POF疾病靶点基因与仙茅-淫羊藿靶点基因匹配情况

2.5 关键靶点基因的蛋白质互作网络通过STRING数据库绘制PPI网络图，选取其中度值（Degree）较高的前10位基因，利用Cytoscape

3.2.1 绘制hub蛋白网络图。见图3—4。

图2 药物（仙茅-淫羊藿）-活性成分-关键作用靶点-疾病（POF）网络

图3 PPI蛋白互作网络

图4 Hub关键蛋白靶点图

2.6 GO与KEGG通路富集分析GO功能富集结果显示，仙茅-淫羊藿活性成分作用于POF的41个关键靶点基因涉及139个GO Terms，富集的生物学过程主要为药物反应（response to drug），RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter），DNA模板（positive regulation of transcription，DNA-templated），信号转导（signal transduction），对E2的反应（response to estradiol），对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide），RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始（transcription initiation from RNA polymeraseⅡpromoter），细胞增殖的正调控（positive regulation of cell proliferation），凋亡过程（apoptotic process），腺苷酸环化酶活性的激活（activation of adenylate cyclase activity），对有毒物质的反应（response to toxic substance），肽基丝氨酸磷酸化（peptidyl-serine phosphorylation），老化（aging），ERK1和ERK2级联的正调节（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade），血管生成（angiogenesis），化学性突触传递（chemical synaptic transmission），细胞信号转导（cell-cell signaling），细胞增殖的负调控（negative regulation of cell proliferation），提示仙茅-淫羊藿可能通过调节上述主要生物学过程而发挥治疗POF的作用。见图5。

图5 仙茅-淫羊藿活性成分治疗POF共同靶点的GO生物学过程富集分析

KEGG通路富集分析显示，仙茅-淫羊藿的活性成分作用于POF的41个关键靶点基因有60个GO Terms，其主要富集相关通路为癌症途径、cAMP信号通路、病毒致癌、血清素能突触、钙信号通路、甲状腺激素信号通路、多巴胺能突触、癌症中的蛋白多糖、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、p53信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、肿瘤坏死因子信号途径、MAPK信号通路等，提示仙茅-淫羊藿的活性成分靶点可能通过上述通路作用于POF，可作为未来研究仙茅-淫羊藿药对治疗POF疗效的重要方向。见图6。

图6 仙茅-淫羊藿活性成分治疗POF共同靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论

二仙汤是由张伯讷教授创制的经验名方，以仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏、知母为药物组成，全方阴阳并用，以温肾阳药物仙茅、淫羊藿为主，故名“二仙汤”，临床广泛用于治疗卵巢早衰、围绝经期综合征、不孕症等。现代药理学研究表明仙茅具有改善生殖轴功能以促生殖的作用，淫羊藿具有雌性激素样作用［7-8］。

本研究结果显示，β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇3个活性成分作用于疾病关键靶点基因最多。其中Degeree前3的关键靶点基因为前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、核受体共激活剂2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）及前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1），表明以上成分及基因是仙茅-淫羊藿治疗POF的重要成分及重要靶点基因，在仙茅-淫羊藿药对治疗POF中有重要意义。β-谷甾醇、豆甾醇属植物甾醇，是合成固醇类激素的前体，具有类雌激素作用，对雌激素受体具有亲和力［9］。β-谷甾醇具有抗炎、调节人体甾体激素等作用，亦能够刺激卵巢颗粒细胞分化［10-11］。槲皮素属植源性黄酮类化合物，结构类似于固醇类雌激素，在体内主要与雌激素受体结合，发挥弱雌激素样作用［12］。因此，可认为β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是该药对治疗POF的主要活性成分。前列腺素内过氧化物合酶（PTGS）是合成前列腺素（PGs）的重要限速酶，目前发现该酶包含结构型PTGS1和诱导型PTGS2两类，但在组织分布和表达调控方面有明显差异，PTGS1属组成性表达，而PTGS2是诱导性酶，通常在炎性反应、激素和肿瘤启动子中被高度诱导［13］。卵巢颗粒细胞受LH刺激后可诱导PTGS2表达［14］。而前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是介导LH峰的关键，在卵泡发育中可直接刺激卵丘细胞扩展、卵母细胞成熟和卵子排出，其主要由颗粒细胞合成，分泌胞外后结合至卵丘细胞上的PGE2受体2和PGE2受体4（PTGER2、PTGER4），这两种受体均通过活化胞内偶联的Gas蛋白，进而激活腺苷酸环化酶，增加胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量并促进透明质酸合酶2和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)介导蛋白6的合成，引起卵丘细胞扩展，因此由PTGS/PGESPGE2-PTGER构成的PGE2网络涉及卵泡发育的各个阶段，尤其对细胞内cAMP浓度的调节及类固醇的合成，并激活PKC/PKA等信号通路的传导发挥了重要作用［15］。故仙茅-淫羊藿药对可能通过调节PTGS2、PTGS1靶点，促进PGE2合成，进而促使卵泡发育和成熟。NCOA2属类固醇受体辅激活因子家族，可与受体相互作用从而以一种配体依赖模式增强转录活性［16］。

蛋白质相互作用网络分析发现度值较高，且与其他靶点相互作用较密切的有转录因子AP-1（transcription factor AP-1，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3，CASP3）、PTGS2、孕酮受体（progesterone receptor，PGR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARG）、雄 激 素 受体（androgen receptor，AR）、周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase 2，CDK2）等（颜色越深，度值越高），可视为中药活性化合物发挥作用的核心基因。研究发现当细胞受到损伤时可激活CASP3从而诱导细胞凋亡［17］。PGR可介导孕酮的生理作用，属于甾体激素核受体家族成员，作为配体活化的转录因子在生殖活动中以及对介导与调节卵巢、子宫、乳腺功能发挥重要作用［18-20］。AR可参与卵泡生长的调节［21］，POF患者中AR基因（CAG）n重复序列延长，引起AR功能减弱、雄激素活性降低，进而导致雄激素对卵泡生长的调节功能异常，从而造成卵巢功能减退，成为卵巢早衰的可能致病因素［22］。本研究通过蛋白质相互作用网络验证了仙茅-淫羊藿药对中的化合物是通过多靶点、整合调节的方式发挥作用。

GO富集分析和KEGG通路富集发现仙茅-淫羊藿药对中活性成分可通过参与多种生物过程调节卵巢细胞信号转导，促进细胞增殖、血管生成，抑制细胞凋亡等，这些靶点主要调节甲状腺激素、细胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介导的卵母细胞成熟、TNF、P53、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）等信号通路发挥治疗作用。其中甲状腺素可恢复卵巢颗粒层-卵泡膜细胞上的FSH和LH受体并对内源性促性腺素有促进作用，从而促进卵巢中残存的始基卵泡发育［23-24］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）存在于卵母细胞中，参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞增殖、分化，是细胞增殖和凋亡最主要的信号传导通路之一［25］，PI3K-Akt的过度激活可促使原始卵泡过早发育及卵泡过快凋亡，进而发展成为POF［26］。FSH可结合至卵巢颗粒细胞膜上的特异性受体并激活上游的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路继而激活下游的PI3K/Akt通路和MAPK通路，诱导芳香化酶基因转录，调控雌激素和孕激素分泌，促使卵巢颗粒细胞成熟［27］，这对POF早发现、早治疗甚至恢复卵巢功能有重要意义。TNF-α在体内的含量上升会导致早期卵泡出现凋亡，加快颗粒细胞（卵巢）凋亡［28-29］。LIANG等［30］研究发现p53信号通路可促进卵巢颗粒细胞凋亡。MAPK通路能够调控基因表达及细胞的增殖、分化和凋亡［31］。因此，以上通路很可能是仙茅-淫羊藿药对治疗POF的潜在信号通路。

综上所述，本研究发现仙茅-淫羊藿药对中的β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等成分可能通过PTGS2、PTGS1、NCOA2等靶点作用于甲状腺激素、细胞凋亡、PI3K-Akt、孕酮介导的卵母细胞成熟、肿瘤坏死因子信号途径、P53、MAPK等多条信号通路发挥作用。因此，仙茅-淫羊藿药对治疗POF的药理学机制可能是通过多组分、多靶点、多通路实现。但由于数据库信息纳入可能不全，中药煎煮过程中成分的改变及相互作用，人体内药代动力学的影响等，纳入分析的成分不一定能真实反映人体内发挥治疗作用的成分，故本研究存在一定局限性，其复杂的作用机制有待进一步实验验证。