基于网络药理学探讨丹参治疗血管性痴呆的作用机制*

陈静，陈炜，唐秀松，伍媛，劳祎林，吴林△

1广西中医药大学，广西 南宁 530001；2广西中医药大学第一附属医院脑病一区

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指由于各种脑血管疾病引起脑损伤，导致不同程度认知功能障碍的疾病［1］。表现为学习和记忆能力减退、运动功能障碍、情绪行为异常等［2-3］。我国人口老龄化呈上升趋势，老年性痴呆的人数也越来越多，其中VD患者约占老年性痴呆患者的20%［4］。相关文献报道［5-8］，VD的发病主要与胆碱能系统障碍、氨基酸神经递质、氧自由基增多、神经细胞凋亡等有关。VD是现阶段唯一可逆的痴呆类型疾病［9］。由于VD复杂的发病机制，单纯靠西药治疗可能不是很好的解决办法［10］，中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，在防治VD方面发挥独特优势［11-12］。何欢等［13］通过中医传承辅助平台软件分析了155首治疗VD的方剂，发现丹参在中药方中的使用频率排第3位。董菲等［14］运用关联规则研究了治疗VD的101首方剂，在支持度为20的条件下，丹参-石菖蒲、丹参-黄芪、丹参-川芎、丹参-何首乌药对的使用频率较高。李强等［15］在数据挖掘治疗VD的方中发现丹参用药频率排第3位。可见，丹参在VD的治疗中出现频率较高。丹参，别名血参根、大红袍、红根，为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根茎［16］，丹参味苦，微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、凉血消痈、清心除烦、通经止痛等作用。常用于治疗胸痹心痛、脘腹胁痛、热痹、心烦失眠、痛经等病症［17-18］。药理研究报道，丹参具有改善血液循环、抗炎、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化及调节血糖、血脂和血压等的作用［19-26］。

网络药理学是一种基于对“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络进行整体分析的新技术，能展示中药有效成分作用于人体起治疗作用的机制［27］。本研究采用该技术探讨丹参治疗VD的作用机制，以期为丹参的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 丹参有效成分的检索和筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），选择“Herb name”，以“丹参”为关键词搜索其全部有效成分。

1.2 丹参靶点基因获取在TCMSP中以“丹参”为关键词，选择“Related Targets”栏，导出结果。并通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）查询其蛋白所对应的基因，用Perl 5.26.3软件（https：//www.perl.org/get.html）注释筛选出的靶点基因。

1.3 VD疾病相关基因检索分别在GeneCards数据库（https：//genealacart.genecards.org/）、OMIM数 据 库（https：//www.omim.org/）中 输 入“Vascular dementia”，检索VD相关靶点基因，以表格形式下载，export导出结果，去除重复项，最后得到VD疾病基因数据集。

1.4 韦恩图绘制将得到的丹参有效成分和靶点进行整理，所得数据导入R×64 3.6.2软件（https：//www.r-project.org/），进行相应脚本运算，得出丹参靶点和VD疾病靶点交集。

1.5 丹参-有效成分-VD-靶点调控网络构建将丹参靶点和丹参-VD靶点利用Perl软件进行映射，然后运用Cytoscape 3.7.2软件（https：//cytoscape.org/）对该网络进行拓扑计算，得到丹参-成分-VD-靶点调控网络。

1.6 丹参-VD靶点蛋白相互作用网络构建与核心基因筛选利用SRRING在线软件（https：//string-db.org/）将丹参-VD靶点输入软件Multiple Proteins列表下的List of Names中，在Organism中选择homo sapiens，保存结果文件，将所得文件输入R×64 3.6.2软件，计算得到蛋白互作网络核心靶点条图。

1.7 基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）将丹参-VD靶点利用R×64 3.6.2软件计算得到GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 丹参有效成分和靶点共搜索得到202个化合物。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，药物类药性（drug likeness，DL）＞0.18为筛选条件［28］得到65个有效成分，根据OB由大到小展示前20位，见表1。

表1 丹参中有效成分和靶点筛选结果（排名前20）

续表1

2.2 韦恩图丹参-VD交集靶点有86个。其中VD疾病靶点3901个，丹参靶点108个。见图1。

图1 丹参有效成份-VD靶点

2.3 丹参-有效成分-VD-靶点调控网络图中红色五边形代表疾病VD，黄色菱形形代表中药丹参，紫色V形代表丹参抗VD的有效成分，蓝色圆形代表丹参与VD疾病共同靶点，表明丹参主要通过54种有效成分作用于86个靶点，这86个靶点可能影响VD疾病的发生。见图2。

图2 丹参-成分-VD-靶点调控网络

2.4 丹参-VD靶点蛋白相互作用网络与筛选核心基因丹参-VD核心基因按邻接节点数目由多到少依次为Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1、EFGR、MYC、JUN、STAT3、CASP3、PTGS2、CCND1、MAPK14、MMP9、RELA、APP、ESR1、PPARG、BCL2L1、IL10等。邻接节点数目越多，成为核心基因的概率越大，故Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1可能为核心基因。见图3—4。

图3 丹参-VD靶点蛋白相互作用网络

2.5 GO功能富集分析丹参-VD靶点涉及的GO功能共富集到130条生物过程，主要包括G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体活性、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、儿茶酚胺结合等。见图5—6。

图4 丹参-VD蛋白互作网络核心靶点条图

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

2.6 KEGG通路富集分析丹参治疗VD的核心靶标的KEGG通路富集分析共富集出134条通路与治疗VD的功效相关，主要包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、非小细胞肺癌、乙型肝炎病毒通路、IL-17信号通路等。见图7—10及表2。

表2 KEGG富集分析通路

图7 KEGG通路富集分析柱状图

图8 IL-17信号通路

图9 AGE-RAGE信号通路

图10 HIF-1信号通路

3 讨论

中医无“血管性痴呆”的病名，“痴呆”一词最先记载于《华佗神医秘传·华佗治痴呆神方》，血管性痴呆属“呆病”“健忘”“文痴”“武痴”“癫狂”等范畴［29-30］。一般将VD的证候分为肾精亏虚、痰浊阻窍、瘀血阻络、肝阳上亢4种证型［31］。丹参有活血化瘀功效，符合瘀血阻络病机。前期研究证实［21］，以丹参为君药的中药方剂和有效成分能改善微循环缺血再灌注后引起的心、脑功能障碍和器官损伤［32］。

从表1可知，丹参主要有效成分有65个，包括紫丹参萜醚、醛基丹参酮、丹参醌新酮、表丹参螺缩酮内脂、丹参醇B、丹参醇A、紫丹参素C、异隐丹参酮、新隐丹参酮、隐丹参酮等。从图2可知，丹参治疗VD的有效成分是54个，主要有丹参醇B（Danshenol B）、丹参醇A（Danshenol A）、1，2，5，6-四氢丹参酮（1，2，5，6-tetrahydrotanshinone）、多孔甾醇（Poriferasterol）、丹参新醌（danshexinkum d）、丹参酮（tanshinoneⅥ）、异欧前胡素（isoimperatorin）、丹参酮ⅡA（DehydrotanshinoneⅡA）、二乙醇酸盐（digallate）、木犀草素（luteolin）、醛基丹参酮（formyltanshinone）、紫丹参萜酸A（przewalskin a）、紫丹参萜酸B（przewalskin b）等。

从图1和图3的PPI网络中发现丹参治疗VD的核心靶点主要是Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等。Akt（又称PKB，protein kinase，PKB/Akt）是一种与蛋白激酶C相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［33］。Akt是磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号传导通路中一个关键的下游靶激酶，G蛋白偶联受体、蛋白酪氨酸激酶受体和Ras蛋白可激活PI3K［34-35］。PI3K/Akt信号通路对神经细胞凋亡、增殖、分化及脑血管舒缩功能起重要作用，在VD防治中PI3K/Akt信号通路是一个热点通路［36-39］。白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一种嗜神经细胞因子，主要调控免疫和炎症反应［40］。血清IL-6表达水平与VD的严重性相关［41］。研究证实，炎症因子IL-6和动脉粥样硬化的致炎进程有关，它可损伤血管，加快动脉粥样硬化发生发展，加重脑血管病变、神经细胞凋亡，患者最后出现认知功能减退等痴呆症状［42-43］。丹参酮ⅡA有抗凋亡作用，可降低IL-6水平［44-45］。FOS，别名AP-1，C-FOS，p55。C-FOS基因是一种原癌基因［46］，在细胞生产调节和胞内信号传递分泌中发挥关键作用，减少C-FOS入核可阻碍炎性因子转录与蛋白合成，最后减轻炎症程度［47］。丹参提取物和丹参化学成分可下调C-FOS表达水平［48］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与很多血管生成依赖性疾病（包括脑血管病）的发生发展［49］。隐丹酮能够调控VEGF，调控Src/FAK和ERK1/2信号途径，抑制VEGF诱导的血管 生 成［50］。丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是一组能被不同细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的具有调节细胞生长、增殖、趋化作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶［51］。MAPK是促进炎症反应的重要信号分子。MAPK1又称p38 MAPK，是MAP激酶家族的一个成员［52］，p38 MAPK抑制剂能够保护VD大鼠海马区功能损伤［53］。

GO功能富集分析发现，丹参治疗VD的基因功能主要调节G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体活性、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、儿茶酚胺结合、类固醇激素受体、神经递质受体活性、酰胺结合等。

KEGG通路富集分析发现，丹参治疗VD通路主要有信号通路、癌症通路、代谢通路、感染通路等。其中信号通路有白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。IL-17归于CD4+效应性T细胞，与人体细胞结合会使IL-17水平明显升高，并且IL-17能诱导基质细胞，产生TNF和IL-6等，最终导致炎性细胞浸润［54-55］。研究证实，VD患者IL-17水平高于健康人群，说明白细胞介素在VD起病早期可作为诊断依据之一，提前切断其发生发展［56］。血清中晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）和β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）可能是VD患者和急性脑梗死患者发病的危险因素，推断它们参加脑血管损伤，引起脑梗死，最后发生VD。AGEs与PC12细胞神经毒性损害和RAGE诱导NF-κB表达密切相关。VD患者血清AGEs升高，并和简易智力状态检查量表（Mini-mental state examination，MMSE）评分呈负相关［57］。低氧诱导因子1α（HIF-1α）是低氧反应的调控因子，可以调控下游靶基因发挥脑组织保护作用［58］。其中HIF-1α激动剂能保护VD患者的神经［59］。丹参中的隐丹参酮可以下调HIF-1α表达水平［60］。

综上所述，丹参抗VD的主要有效成分有丹参醇、1，2，5，6-四氢丹参酮、多孔甾醇、丹参新醌、丹参酮Ⅵ、丹参酮ⅡA、木犀草素等54个有效成分。丹参通过Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等核心靶点调控130条生物学过程和134条KEGG通路，说明丹参是通过多成分、多靶点和多途径调控VD。该研究可为VD的治疗提供思路，为丹参的临床及实验研究提供一定的理论依据。