FAdV-4通过Inc87774-MDM2-p53通路诱导鸡肝细胞凋亡的分子机制

摘要：由禽腺病毒4型（FAdV-4）引起的禽心包积液性肝炎综合征近年来在我国频频发生，给我国家禽养殖业造成了巨大损失。长链非编码RNA（incRNA）是病毒感染期间宿主免疫反应的关键调节因子，为揭示其在FAdV-4感染时对宿主细胞的作用及机理，本研究以鸡肝癌细胞系LMH为对象，通过芯片测序、生物信息学分析及Real-time PCR等方法筛选病毒感染过程中的关键incRNA分子，并通过荧光定位杂交、编码一非编码基因共表达（CNC）分析、Real-Lime PCR、酶联免疫吸附（ELLSA）、RNA pull-down和蛋白免疫共沉淀（RIP）、流式细胞分析等分子生物学手段对其进行亚细胞定位及互作蛋白的筛选、验证和功能分析。结果表明，筛选出了FAdV-4感染引起的关键incRNA分子inc87774，其主要定位在细胞质，其靶向结合互作蛋白为E3泛素连接酶MDM2，过表达inc87774，MDM2和Bcl-2的相对表达量显著上升，p53和Bax的相对表达量显著下降，显著抑制细胞凋亡；沉默inc87774，上述基因表现出相反的变化趋势且显著促进细胞凋亡；进一步沉默MDM2后，p53的表达量显著上调，但同时过表达／沉默inc87774对FAdV-4引起的细胞凋亡没有影响，表明FAdV-4感染LMH细胞过程中inc87774通过MDM2靶向调控p53介导的细胞凋亡进程。该研究结果将增加我们对FAdV-4与宿主细胞互作的认识，为宿主抗病毒防御机制提供理论支持。

关键词：禽腺病毒4型；长链非编码RNA；蛋白互作；细胞凋亡；先天性免疫；致病机理

中图分类号：S858.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2025）01-0142-09

禽腺病毒4型是一种无囊膜的dsDNA病毒。近年来，FAdV -4引起的禽心包积液性肝炎综合征广泛流行。对我国家禽绿色健康养殖构成巨大的威胁。被FAdV-4感染的家禽通常会出现急性死亡，死亡高峰集中在感染1周之内，死亡家禽出现典型的心包积液以及包涵体肝炎症状。此外，FAdV-4感染能够导致宿主的免疫抑制，由此导致的免疫失败、继发感染、混合感染进一步加剧了HHS的危害。FAdV-4宿主广泛，不仅感染规模养殖的蛋鸡、肉鸡、肉种鸡，也可以感染鸭、鹅以及多种野生鸟类，FAdV-4感染宿主的多样性增加了跨宿主传播的潜在风险，给该病的科学防控增加了难度。FAdV-4抵抗力强，即可以水平传播，也可以垂直传播，导致其防控难度大。因此，为保障养殖业健康发展，加强对FAdV-4致病机制的研究十分必要。

天然免疫是机体抵抗病原体入侵的第一道屏障，具有保护机体免受外源病原微生物入侵和清除自身衰老或损伤细胞的重要功能。长链非编码RIVA（long noncoding RNA，IncRNA）作为一种新的调节因子，在病毒和宿主相互作用过程中发挥着重要的调节作用，广泛参与病毒的感染过程并双向调控宿主天然免疫反应。研究表明IncRNA参与各种不同的生物学过程并在其中发挥着重要作用，包括细胞生长和分化、凋亡、自噬、免疫反应和肿瘤的发生等。例如，IncRNA-ELIT-l作为Smad3的辅助因子能促进TCF-B/Smad信号传导和上皮一间质的转化。聚核梭杆菌靶向lrtcRNA EN01-IT1促进结直肠癌的糖酵解和肿瘤发生。在官颈癌研究中，LncRNA TUG1能够竞争性结合miRNA-381-3p导致MDM2靶基因表达量升高以减轻细胞凋亡。

病毒已经进化出多种策略来逃避免疫系统的消除，越来越多的研究表明，IncRNA在宿主抗病毒反应中起到至关重要的作用，是病毒感染期间宿主免疫反应的关键调节因子。目前，关于IncRNA的研究在动物疾病方面也有很多的报道。例如IncRNA TCONS_0179042在Mare-145细胞中能抑制猪繁殖与呼吸道综合征病毒的复制。Lu等鉴定并分析了H5Nl亚型禽流感病毒感染鸭后得到的IncRNA表达谱，并发现其中58条IncRIVA与抗H5Nl亚型禽流感病毒免疫反应相关：Li等鉴定并分析了禽传染性支气管炎病毒感染HD11细胞的IncRNA表达谱，发现IneRNA在宿主抗IBV反应中起到至关重要的作用；Chai等在流感病毒与宿主相互作用研究中发现，IncRNA ISG20在流感病毒感染和复制过程中发挥关键性作用，并揭示了IneRNA ISG20作为一种新型干扰素诱导基因在宿主抗病毒天然免疫防御系统中的作用。因此，我们推测IncRNA在FAdV-4对宿主细胞的感染过程中也可能扮演着重要的角色，而其在宿主细胞中的作用与机理还不清楚，有待深入研究。本研究以鸡肝癌细胞系LMH为宿主细胞，通过芯片测序等手段筛选FAdV-4感染过程的关键IncRNA及互作蛋白，并利用多种分子生物学方法探究其作用机制，以期为FAdV-4的防治提供理论支持。