双缩脲法与福林酚法辨析及应用评价

摘 要：文章旨在辨析双缩脲法和福林酚法的术语概念，研究改进二者测量血清总蛋白的操作方法，探讨这两种方法检测血清总蛋白含量在教学中的适用性，为临床上对血清总蛋白的检测提供改良思路。通过改进双缩脲法和福林酚法分别对40个健康体检人员的血清进行总蛋白含量测定，并考察标准曲线的精密度、重复性以及加样回收率。结果发现：两种方法检测待测血清样品中总蛋白含量与医院检测结果基本一致。可见，两种方法均适用于血清总蛋白含量的测定。由于双缩脲法检测时间短、操作简单，比福林酚法更适用于实验教学，值得进一步推广。

关键词：双缩脲法；福林酚法；血清总蛋白测定

中图分类号：H083；R4" DOI：10.12339/j.issn.1673-8578.2025.01.021

Application Evaluation of Improved Biuret Method and Folin-Phenol Reagent Method for Determination of Serum Total Protein Content//ZHANG Qian， LIN Yanyan， CAI Binxiang

Abstract：Objective： The purpose of this paper is to differentiate and analyze the term concepts of biuret method and Folin-Phenol method， improve the operation method of measuring serum total protein by the two methods， and to discuss the applicability of these two methods to detect serum total protein content in teaching， and to provide improved ideas for clinical detection of serum total protein. Methods： The improved biuret method and Folin-Phenol method were used to determine the total protein content in the serum of 40 healthy people， and the precision， repeatability and the sample recovery rate of the standard curve were investigated. Results： The total protein content in the serum samples detected by the two methods was basically consistent with the hospital test results. Conclusion： Both methods are suitable for the determination of serum total protein content. Due to the short detection time and simple operation， the biuret method is more suitable for experimental teaching than the Folin-Phenol method， which is worthy of further promotion.

Keywords： biuret method; Folin-Phenol method; determination of serum total protein

收稿日期：2024-08-30" 修回日期：2024-10-28

基金项目：2023年度福建省中青年教师科研项目（科技类）（JZ230086）；2023漳州市自然科学基金（ZZ2023J25）

作者简介：章倩（1986—），漳州卫生职业学院主管护师，研究方向为海洋天然产物活性研究、生物化学与生物化学检验、综合实训管理研究，通信方式：303916828@qq.com。*通讯作者：蔡彬祥（1992—），博士，漳州卫生职业学院讲师，研究方向为生物化学与分子生物学研究。通信方式：2267217008@qq.com。

1 血清总蛋白测定方法：双缩脲法与福林酚法

血清总蛋白（total protein，TP）是血清中所含各种蛋白质的总称^[1]，对于维持机体渗透压及保持水分平衡极为重要，可维持血液的酸碱度，在机体中发挥重要的生理功能。临床上对血清总蛋白含量的测量是生化检验的重要项目之一，可协助肝脏功能、肾脏疾病或营养状况等疾病的诊断^[2-3]，因此，掌握测定血清总蛋白的原理和方法是医护人员必备的生化检验技能之一。

双缩脲试剂是一种碱性的含铜溶液，在临床上常用于测定血清总蛋白的含量。蛋白质是由氨基酸通过肽键 （—CO—NH—）相互结合而成的，其在双缩脲试剂中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。这种紫红色络合物在540nm波长处有最大光吸收值，其吸光值在一定范围内与蛋白质含量呈正比关系， 据此可通过分光光度法测定蛋白质浓度。双缩脲法可较准确地测定血清总蛋白，具有操作简便快捷，既适合手工操作又适合自动化分析，重复性、线性关系好等优点，但其灵敏度相对较低，通常用于需要快速但并不十分精确的蛋白质测定。

福林酚法测定血清总蛋白是双缩脲法的发展。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成紫色络合物；该络合物及蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等残基可将福林酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的蓝色混合物。该混合物在560nm波长处有最大光吸收值。这个方法操作简便、灵敏度高，检测的最低蛋白质量可达5μg，比双缩脲法灵敏得多。但福林酚试剂显色反应是由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用；且其操作时间相对较长，需要精确控制。

在当前测定血清总蛋白的教学中，为了更好地模拟临床上对血清总蛋白含量的测定，教学使用的待测血清样品通常从医院临床样品中获得，来源单一且所得量较少。然而，目前常用测定血清总蛋白的方法所需待测血清样品和相关检测试剂的量均较多，增加了教学成本，其按部就班的操作流程降低了学生的动手能力，极大影响了学生的积极性和独立思考的能力。且利用紫外分光光度仪检测比色皿中溶液的吸光值存在灵敏度较差和精度不高的问题，也会降低学生的成就感。因此，本文通过改进双缩脲法和福林酚法测定临床样品中血清总蛋白的含量，按比例降低待测血清样品和检测试剂的使用量，结合精度较高的酶标仪进行检测，通过标准曲线的绘制、精密度、重复性、加样回收率以及对样品总蛋白的测定，评价它们在实验教学中的适用性。具体方案如下。

2 实验仪器与试剂

2.1 仪器

Thermo酶标仪；高精度微量电子天平；HVM1型漩涡振荡器。

2.2 标本

随机选择2023年9月19日—2024年6月30日于漳州市医院进行健康体检的40例检测者，男女各20例，年龄20～60岁，利用肝素钠抗凝真空采血管采集患者静脉血3mL。充分混匀后以4000rpm离心旋转5min，及时分离血浆。所有标本均无溶血、黄疸和脂浊，其检测结果均在线性范围内。

2.3 试剂

牛血清白蛋白标准品溶液1mL/支，浓度为70.4mg/mL；双缩脲试剂盒；福林酚试剂盒。NaOH、Na2CO3、酒石酸钾及CuSO4·5H2O均为分析纯；实验用水为ddH2O（双蒸水）。

2.4 数据处理

所得的各组数据至少重复3次，均取平均值；所有数据运用EXCEL软件分析和绘制图片^[4]。

3 方法与结果

3.1 双缩脲法

3.1.1 制备标准溶液

标准溶液为牛血清白蛋白溶液，浓度为70.4mg/mL。用ddH2O精密地对牛血清白蛋白标准溶液进行梯度稀释，将其稀释成如下溶度：0， 4.4， 8.8， 17.6， 35.2， 52.8， 70.4 mg/mL。

3.1.2 标准曲线制作

用移液枪精密测量上述浓度标准溶液，加到96孔板中，每孔各5μL。接着，移取200μL双缩脲试剂溶液到每孔当中，并混匀。置于黑暗环境下，37℃孵育反应10min，再放入酶标仪中，振荡5秒后测定相应吸光值，该波长为550nm。以吸光度为纵坐标，各个浓度标准溶液为横坐标制作标准曲线，如图2.1所示，其回归方程为Y=0.0038X+0.0824，R²为0.9988，表明该方法中吸光值与各个浓度标准品溶液具有良好的线性关系，可应用于测定血清总蛋白的含量，蛋白质线性浓度范围为0～72.77mg/mL。

3.1.3 精密度

精密量取浓度为17.6， 35.2， 52.8mg/mL的牛血清白蛋白标准品溶液各5μL，分别加入到96孔板中，每个浓度各做6份平行样。按上述进行吸光值的测定，并计算RSD（相对标准偏差）。由表1可知，3个不同浓度样品的RSD均小于1%，说明本测定方法的精密度较好。

3.1.4 重复性实验结果

随机选择一名就医者的血清样品，精密量取该血清样品6份，按照上述方法测定吸光值，根据线性回归方程计算血清总蛋白的含量，并计算RSD，检验该方法的重复性。由表2可知，测定含量平均值为74.5mg/mL，RSD为1.39%，说明本测定方法的重复性良好。

3.1.5 加样回收率

随机选取血清样品8号作为样品，经漳州市医院测定，该血清总蛋白的含量为64.8 mg/mL。精密量取35mg/mL的标准品溶液与该血清样品各30μL置于同一试管，混匀后取5μL加入96孔板中， 做6个复孔，按照上述方法进行含量测定，并计算平均回收率。由表3可知，平均回收率为106.6%，RSD为1.85%。

3.1.6 样品测定

取40个临床血清样品各5μL，分别加入到96孔板中，均做3复孔；按照上述方法进行血清总蛋白含量测定。40个血清样品含量测定结果见表4。

3.2 福林酚法

3.2.1 制备标准溶液

标准溶液为牛血清白蛋白溶液，其浓度为70.4mg/mL。用ddH2O精密地对牛血清白蛋白标准溶液进行梯度稀释，将其稀释成如下溶度：0，0.55，1.1，2.2，4.4，8.8，13.2，17.6mg/mL。

3.2.2 福林酚试剂制备

甲试剂：按照福林酚试剂盒提供的说明书进行配备，现用现配。

乙试剂：浓度为1mol/L，此为福林酚试剂应用液。密封于4℃冰箱中避光保存。

3.2.3 标准曲线的制作

用移液枪精密量取上述各个浓度标准品溶液各5μL，分别加入到96孔板中。接着，往每孔中加入200μL甲试剂溶液，混匀，于25℃的室温中避光静置10min。反应结束后，再往各孔加入20μL的乙试剂混匀，置于黑暗环境下，在25℃的室温下反应静置30min。最后，利用酶标仪测定相应的吸光值，该波长为500nm，以吸光值为纵坐标，各浓度标准溶液为横坐标制作标准曲线，如图2所示，其回归方程为Y=0.0299X+0.0664，R²为0.9983，表明该方法中吸光值与各个浓度标准品溶液具有良好的线性关系，可应用于测定血清总蛋白的含量，蛋白质线性浓度范围为0～17.69mg/mL。

3.2.4 精密度实验结果

精密量取浓度为2.2， 4.4，8.8mg/mL的牛血清白蛋白标准品溶液各5μL，分别加入到96孔板中，每个浓度各做6份平行样。按上述进行吸光值的测定，并计算RSD。由表5可知，3个不同浓度的样品的RSD均小于1%，说明本测定方法的精密度较好。

3.2.5 重复性实验结果

随机选择一名就医者的血清样品，将其稀释10倍后，精密量取该血清样品6份，按照上述方法测定吸光值，根据线性回归方程计算血清总蛋白的含量，并计算RSD，检验该方法的重复性。由表6可知，测定含量平均值为74.5mg/mL，RSD为1.52%，说明本测定方法的重复性良好。

3.2.6 血清总蛋白加样回收率

随机选取血清样品8号作为样品，经漳州市医院测定，该血清总蛋白的含量为64.8 mg/mL。精密量取8.8mg/mL的标准品溶液与经稀释10倍的该血清样品各30μL置于同一试管，混匀后取5μL加入96孔板中，做6个复孔，按照上述方法进行含量测定，并计算平均回收率。由表7可知，平均回收率为111.1%，RSD为1.72%。

3.2.7 样品测定

将40个血清样品稀释10倍，从稀释血清样品中各取5μL，分别加入到96孔透明板中，各做3个复孔。按照上述方法进行血清总蛋白含量测定。40个血清样品含量测定结果见表8。

4 讨论

4.1 双缩脲法

目前临床及教学多采用双缩脲法测定血清总蛋白含量^[5]，然而在教学上运用该方法所使用的检测试剂及待测血清样品用量都较多，且所利用的紫外分光光度仪检测吸光值存在灵敏度较差、精度不高的问题，增加了教学难度。因此，本实验将常规所需的双缩脲试剂用量从1mL减少至200μL，血清样本量从15μL减少至5μL，37℃温浴10分钟后置于精度高的酶标仪进行检测，实验结果显示，待测血清样品中总蛋白含量与医院检测结果基本一致。从检测的精密度、重复性以及临床结果对照的一致性可看出该改良方案可适用于血清总蛋白含量的测定。因其检测时间短、可操作性强、教学成本低、检测的灵敏度和精确度高，可推广运用于对医护学生学习蛋白质检测的实验教学，加强学生对该检验技术原理的理解，提升学生的动手操作能力，同时也可为临床血清总蛋白含量检测提供相应的改良思路。

4.2 福林酚法

福林酚法测定血清总蛋白是双缩脲法的发展，是最灵敏的蛋白质测定方法之一^[6]。实验表明改良福林酚法测定血清总蛋白的结果与医院双缩脲法测定的血清总蛋白含量基本一致，可应用于血清总蛋白含量的测定。但是，因其灵敏度过高，对于操作者的熟练程度要求较高，不适用于对新生的实验教学。同时，本检测方法耗时较多，因教学课时的限制，不适用于传统生化及生化检验实验教学。然而，本文通过稀释血清样品，减少了血清样本用量，可大幅减少血清样品的用量，降低检验成本，或许可将改良的福林酚法推广运用于临床检测。

5 结语

双缩脲法是基于双缩脲反应来进行血清总蛋白的测定，具有操作简便、快速且适用于多种样品类型的特点，但其灵敏度相对较低。福林酚法测定血清总蛋白是双缩脲法的发展，具有较高的灵敏度，能够检测到较低浓度的蛋白质，但是该方法需要精确控制操作时间，对操作者要求较高，且显色反应可能受到样品中酚类、柠檬酸和巯基化合物等的干扰，影响测定结果的准确性。

综上所述，改进的双缩脲法比福林酚法更适用于实验教学，而改良的福林酚法通过稀释血清样品，减少了血清样本用量，可大幅减少血清样品的用量，降低检验成本，或许可将其推广运用于临床检测。在实验教学中，教师可以根据不同层次的学生结合课堂效率、学生的操作熟练度等选择适合的检测方法进行教学。同时，通过常规检测方法和改进检测方法的教学比较，不仅可以锻炼学生的科学思维能力，也更进一步培养了学生进行实验设计与数据处理的科学探究能力。

参考文献

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[2] 纪圆圆，高华峰，董玲玉，等.ZnS量子点荧光分光光度法检测牛血清白蛋白含量的研究[J].北京化工大学学报（自然科学版），2016（5）：69-73.

[3] 范婵，刘艳婷，赵印，等.总蛋白双缩脲法单试剂盒与双试剂盒检测结果的一致性评估[J].医学信息，2018（20）：152-154.

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[5] 王谦.改良双缩脲法测定血清总蛋白的方法与应用[J].中国厂矿医学，2007（6）：668-669.

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