玉米抗莠去津相关性状的全基因组关联分析及候选基因预测

关键词：玉米；莠去津；全基因组关联分析；候选基因；分子标记

中图分类号：S513：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）11-0028-08

玉米（Zea mays L.）作为主要的粮食、饲料和能源作物，在保证国家粮食安全和民生发展方面发挥着不可替代的作用。玉米生长受杂草危害严重，杂草与玉米在地上激烈争夺光照资源，并影响通风，在地下争夺养分与水分，严重影响玉米的生长发育。此外，杂草还是一些病虫害的传播媒介，易引发蚜虫、病毒病等病虫害。化学除草是当前玉米生产中广泛应用的除草方式，具有效果好、成本低等优势。然而，目前玉米生产中使用的除草剂种类繁多，如酰胺类、磺酰脲类、磺酰胺类、脲类、苯氧羧酸类和有机杂环类等，它们的作用方式、除草效果以及残留等存在一定差异。莠去津（atrazine）作为三嗪类除草剂，属选择性内吸传导型除草剂，苗前、苗后均可使用，其通过抑制Di蛋白的活性，干扰光合作用过程中的电子传输系统，从而阻碍植物生长发育，达到除草效果。由于莠去津的杀草功效好且价格较低，在世界各地迅速得到了应用和推广，成为使用最广泛使用的除草剂之一。莠去津一般在玉米3～5叶期、杂草2～4叶期时施药，对玉米较为安全。但是，不同玉米材料对莠去津也存在药害差异，有的材料抗性较好，而有的材料则表现出药害较重的现象，如喷施莠去津后呈褪绿斑、变黄、部分苗叶缘皱缩、叶片卷缩成筒状等症状。而对造成这种抗性差异的遗传机制的认知还存在局限。因此，解析玉米种质抗莠去津差异的遗传机制，选育出有耐／抗除草剂内源基因的玉米种质资源，可减少莠去津除草剂对玉米杂交后代的药害程度。在保证除草效果的基础上，筛选出耐除草剂玉米种质资源并深入解析其遗传基础对玉米抗莠去津除草剂种质创新具有重要意义。

迄今为止，连锁分析与关联分析方法均被证明是复杂数量性状遗传基础解析的有效方法。国内外学者利用上述两种分析方法对作物抗除草剂性状进行QTL（quantitative trait locus，数量性状基因座）定位研究。通过QTL连锁定位，Bhoite等以小麦W7984×Westonia重组自交系为材料，苗期使用三嗪类除草剂处理，以相对叶绿素含量为评价指标，共检测到4个QTLs，其中4A染色体上2个，2D染色体和1A染色体上各1个；Javid等以豌豆Kaspa×PBA的重组自交系为材料，在除草剂胁迫条件下，以豌豆受药害综合评级为表型，检测到16个抗莠去津除草剂相关QTLs；张锐剑以CA19×浙粳22重组自交系群体F_4：5的158个株系为材料，在三叶期喷浓度为2g/L的草甘膦溶液，以枯死时间、存活率和枯死指数3个性状作为评价指标，共检测到3个耐草甘膦相关QTLs。但是，针对玉米抗莠去津差异QTL定位的研究较少。

本研究以包含234份玉米自交系关联群体为材料，基于前期包含56000个SNPs（single nucle-otide polymorphism，单核苷酸多态性）芯片的基因型鉴定结果和该群体抗莠去津表型评价数据，利用全基因组关联分析，规模化鉴定控制玉米抗莠去津相关性状变异的QTNs（ quantitative trait nu-cleotides，数量性状遗传位点）。在此基础上，利用生物信息学分析方法，挖掘相关候选基因，为解析玉米抗莠去津变异的遗传基础提供理论支持，为培育抗除草剂玉米种质资源提供科学支撑。

1材料与方法

1.1试验材料和田间设计

试验选用包含234份玉米自交系的关联群体为材料，其中温带自交系96份，热带自交系138份，均种植于贵阳市花溪区贵州省农业科学院旱粮研究所温室大棚内。玉米种子播于蛭石和营养土按照1：1比例混合的基质内，每份自交系播5粒种子，重复3次。温室培养条件为：昼、夜温度分别为30、26℃，自然光照。玉米二叶期喷施生产上常用的38%莠去津除草剂（12mL/L），对照组喷施清水。

1.2叶绿素含量（SPAD）测定及分析

根据《除草剂防治转基因耐除草剂玉米田杂草田间药效实验准则》，于喷药后第15天，使用携便式叶绿素仪检测每株幼苗第2片叶的叶绿素含量。

利用Microsoft Excel 2016整理数据，利用IBM SPSS Statistics 27.0.1软件进行基本描述、方差等数据分析。

1.3关联群体抗药性调查与分析

喷施莠去津后15天，按照除草剂药害症状分级标准（表1）进行药害分级调查，根据抗性评价分级标准（表2）确定玉米对莠去津的抗药级别。玉米受害率计算公式为：X（%）=[∑（N×S）/（T×M）]×100。其中：X为受害率，N为同级受害株数；S为级别值；T为总株数；M为最高级别。

1.4基因型鉴定与分析

基因型鉴定工作项目组前期已经完成。即采用CTAB法提取基因组DNA，用紫外分光光度计进行DNA浓度和纯度检测。将质检合格的DNA原液一部分稀释至100ng/μL送康普生物（北京）科技有限公司进行基因型数据测定，一部分-20℃保存备用。利用MaizeSNP50芯片对关联群体进行基因型鉴定，剔除数据缺失频率gt;20%、最小等位基因频率lt;5%的SNP标记，剔除无明确位置的SNP标记，获得高质量的SNP标记，用于全基因组关联分析。

1.5全基因组关联分析

结合已有的基因型和表型评价结果，使用R软件GAPIT（genome associated prediction integrat-ed tool）程序包，对SPAD以及玉米受害率进行全基因组扫描，显著性阈值设置为Plt;0.001。根据项目组前期的研究结果，该群体的平均LD（link-age disequilibrium，连锁不平衡）距离为50kb。根据Wu等描述的方法，参照各SNP在基因组中的物理位置，利用MaizeGDB（https：//www.maizegdb.org/genome/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Uniprot（https：//www.uniprot.or）等数据库，对显著性SNP位点上、下游各50kb区段内的基因进行候选基因筛选及功能注释。

2结果与分析

2.1喷施莠去津对玉米叶片叶绿素含量的影响

由表3可见，玉米喷施莠去津处理组与对照组SPAD值有较大差异，组间变异系数为4.05%。从直方图拟合曲线上看，关联群体处理与对照的SPAD均符合正态分布。方差分析发现，关联群体喷药处理组与对照组叶绿素含量呈极显著差异（图1）。

2.2玉米幼苗莠去津抗性鉴定结果

玉米对莠去津除草剂抗感数量和比例均呈偏正态分布趋势（图2），其中，高抗的材料较少，感的材料较多，其次分别为中抗、抗以及高感材料。受害率≤10%的高抗材料有20份，占8.55%：受害率gt;10%～30%的抗性材料有40份，占17.09%：受害率gt;30%～50%的中抗材料54份，占比23.08%：受害率gt;50%～70%的感的材料有91份，占38.89%；受害率gt;70%的高感的材料有29份，占12.39%。48.72%的材料表现出中抗及以上，感及高感材料共占51.28%。

2.3玉米叶片SPAD值及玉米受害率全基因组关联分析

全基因组关联分析结果（图3、图4）显示，共检测到62个莠去津药害胁迫下与SPAD值和受害率显著相关的QTNs。与SPAD值相关的显著QTNs有35个，分别位于玉米的1、3、4、5、6、7、8、9号染色体上，其中1号染色体上有10个，3号和6号染色体上各有5个，4号染色体上有8个，5、8号和9号染色体上各有2个，7号染色体上有1个。与玉米受害率显著相关的QTNs位点有27个，分别位于玉米的1、2、3、4.8、9、10号染色体上，其中1号染色体上有7个，2、8、9号染色体上各有3个，3号染色体上有2个，4号染色体上有5个，10号染色体上有4个。其中PZE-104041162和PZE-104041163为两性状中均定位到的QTNs位点。

2.4玉米抗莠去津相关候选基因预测

针对鉴定出的62个玉米抗莠去津除草剂相关性状显著性QTNs位点，分别在目标位点上、下游各50 kb范围内筛选候选基因。结合基因功能注释，共挖掘出57个与玉米抗莠去津相关的候选基因，其中，与SPAD值相关的基因23个，与玉米受害率相关的基因34个，含未知功能基因19个。其中，候选基因GRMZM2C030768由共定位QTNsPZE-104041162和PZE-104041163共同筛选到，编码SWI/SNF及基质相关的肌动蛋白依赖性染色质亚家族A成员3-样3调节因子：候选基因GRMZM2C311465编码超敏反应蛋白2（HIR2），GRMZM2C017536编码DUF4378结构域蛋白，GRMZM2G172826编码细胞色素P45071A1，GRMrZM2G129431编码锌指相关蛋白，GRMZM2G334791编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（SAPK4）、GRMZM2G177878编码SR01蛋白，这些基因主要参与植物生长发育、植物免疫、植物激素信号传导的调节，生物胁迫以及非生物胁迫响应过程等；GRMZM2C064962、GRMZM2C457309、GRMZM2G157010等19个功能基因未知。各候选基因信息见表4。

3讨论与结论

本研究共鉴定出62个与玉米抗莠去津除草剂相关性状显著关联的QTNs（Plt;0.001），分析获得相关候选基因57个。其中候选基因GRMZM2G311465编码HIR2蛋白，参与植物免疫反应、花青素合成、生物胁迫以及非生物胁迫应答等过程。Nadimpalli等在玉米中发现Zm-HIR2与植物抗病反应相关，参与植物防御；在拟南芥中，AtHIR2参与RPS2复合物的形成、RPS2介导的ETI反应，以及对丁香假单胞菌的抗性：在苹果中，MdHIR2与MdJA22互作可增强JAZ蛋白的稳定性从而抑制花青素的合成。候选基因GRMZM2G017536在拟南芥中参与脱落酸信号传导调控，Koops等发现其参与拟南芥的激素调控应答，不仅多方面调控植物发育，还参与植物对温度、干旱、渗透和盐胁迫的应答。候选基因GRMZM2G172826编码细胞色素P45071A1，植物细胞色素P450主要参与生物合成与生物解毒途径。CYP71A1的首次报道是在鳄梨中，编码一个与果实成熟相关的酶，Chen等研究发现水稻在使用五氟磺草胺除草剂后45071A1被过表达和诱导。候选基因GRMZM2G129431编码光系统Ⅰ的PSI-H亚基，Lunde等研究表明在缺乏PSI亚基PSI-H的情况下，捕光天线蛋白无法将能量转移到光系统Ⅰ，并且状态转换受损。Varotto等发现敲除PSI-H的拟南芥叶片较野生型颜色浅，其叶绿素含量相对减少，生长速度显著降低，在逆境胁迫下可能导致植物受到更严重的影响。候选基因GRMZM2G334791编码的SAPK4是响应代谢、生物和非生物胁迫信号转导的关键元件。Diedhiou等通过培养过表达SAPK4的转基因水稻发现，诱导SAPK4的表达可以促进盐胁迫下种子的萌发与成熟植株的生长发育。盐胁迫下，过表达SAPK4的水稻Na+和Cl-积累量减少，光合作用改善。候选基因CRMZM2G177878在植物的生长发育，应对干旱、冷、氧化、盐碱以及重金属等非生物胁迫中发挥着重要作用。候选基因GRMZM2G030768编码SWI/SNF及基质相关的肌动蛋白依赖性染色质亚家族A成员3-样3调节因子，属于SWI/SNF蛋白家族，与染色体重塑相关，主要参与植物营养生长、生殖发育、植物激素信号传导的调节以及非生物胁迫响应过程，其具体功能尚未可知。这些QTNs可作为后续玉米种质抗莠去津改良的分子标记，所分析的基因可能是影响玉米对莠去津抗性的重要候选基因，为开发玉米抗莠去津分子标记、深入研究基因功能等提供重要靶标。