黑线姬鼠睾丸实时荧光定量PCR内参基因的筛选及验证

摘""" 要：为筛选出不同季节黑线姬鼠睾丸的最适内参基因，基于黑线姬鼠睾丸转录组数据，初步筛选出12个候选内参基因，即ALDOA、GLUL、RABAC1、TEGT、EID3、SYF2、MRPL20、GAPDH、HPRT、18s、B2M、NWD1。以不同季节（春季、夏季、秋季）成年黑线姬鼠的睾丸作为试验材料，进行RNA的提取并反转录成cDNA，再通过实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR， RT-qPCR）检测上述候选内参基因的表达水平。将所得到的循环阈值（Cyclethreshold， Ct）通过GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等分析软件进行基因稳定性的综合分析。结果表明，不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为STF2＞B2M＞GAPDH＞MRPL20＞18s＞HPRT＞ALDOA＞EID3＞RABAC1＞TEGT＞NWD1＞GLUL，其中SYF2是最稳定的内参基因，GLUL是最不稳定的基因。综上，本研究确定了不同季节下黑线姬鼠睾丸的内参基因，为黑线姬鼠功能基因的开发及基因表达的研究提供基础，并为后续黑线姬鼠基因组学的研究提供参考。

关键词：黑线姬鼠；内参基因；表达稳定性；不同季节；qRT-PCR

中图分类号：Q493.5""""""""" 文献标识码：A"""""""" DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.07.009

Screeningand Verification of Reference Genes for Real-time Quantitative PCR Analysis in Apodemus agrarius Testicles

JIN Zhimin， LI Qiang， WANG Yingxin， LI Lu， REN Zhanchen， JIA Xiuqi

（College of life science and technology Mudanjiang Normal University， Mudanjiang， Heilongjiang 157011， China）

Abstract： In order to screen out the optimal internal reference genes of Apodemusagrarius testicles in different seasons， this study was based on the transcriptome data of Apodemus agrarius testicles， twelve candidate reference genes were initially selected， namely ALDOA， GLUL， RABAC1， TEGT， EID3， SYF2， MRPL20， GAPDH， HPRT， 18s， B2M and NWD1. The testicles of different seasons （spring， summer and autumn） were extracted from RNA and reverse transcribed into cDNA.The expression levels of the above candidate reference genes were then measured by Real-time Quantitative PCR.The Cyclethreshold was analyzed by the analysis software GeNorm， NormFinder， BestKeeper and RefFinder. The results showed that the expression stability of 12 candidate reference genes in the testis of Apodemus agrus in different seasons was ranked from high to low as STF2 gt; B2M gt; GAPDH gt; MRPL20 gt; 18s gt; HPRT gt; ALDOA gt; EID3 gt; RABAC1 gt; TEGT gt; NWD1 gt; GLUL， among which SYF2 was the most stable reference gene， GLUL was the most unstable gene. Among them， SYF2 was the most stable reference gene， GLUL was the least unstable gene. This study provides a basis for functional gene development and gene expression research of Apodemus agrarius， and provides a reference for subsequent genomics research of Apodemus agrarius.

Key words： Apodemus agrarius; reference gene; expression stability; different seasons; qRT-PCR

黑线姬鼠（Apodemus agrarius）又名黑线鼠、田姬鼠、长尾黑线鼠等[1]，隶属于啮齿目鼠科姬鼠属，是常见的农田害鼠，在我国东北、华北、长江以南地区均有分布[2-4]。黑线姬鼠主要以农作物为食[5]，影响农业生产[6]，是典型的农业有害生物。雄性黑线姬鼠在繁殖季节会发生睾丸下降，即睾丸膨大，自腹腔坠入阴囊。睾丸下降是为了提高雄性的繁殖强度，也是影响黑线姬鼠种群数量的繁殖特征之一[7-8]。睾丸下降表现出一定的季节和地区差异性[9]，如春季和夏季，安徽地区的黑线姬鼠睾丸下降率较高[10]，而春季、夏季和秋季，洞庭湖区域的黑线姬鼠睾丸下降率较高[8]。目前针对黑线姬鼠睾丸的研究多集中于其生态调查方面，主要是将睾丸下降率作为解释黑线姬鼠种群变化规律的参数之一，而对于其内在基因调控机制的研究甚少。

随着分子生物技术的不断发展，人们对于生物学研究逐渐深入，更加注重调控生物表型变化的内在分子机制，如基因水平的表达特征。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）作为常用的基因表达水平检测方法[11]，具有操作简单、重复性强、特异性好等优势[12]，已被广泛用于基因表达分析和转录组数据验证等常见分子生物学研究[13-14]。待测样本的RNA质量浓度、反转录效率和引物特异性等都会对qRT-PCR的结果产生影响[15]，因此需要引入合适的内参基因作为对照，对基因的表达水平进行校准，保证试验结果的准确性[16-17]。目前，动物中常见的内参基因有18s小亚基单位核糖体核酸（18s）、β2-微球蛋白（B2M）、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等[18-20]。研究发现，内参基因的稳定性在不同季节、不同器官和不同发育阶段等条件下存在差异，适用于所有条件下的稳定内参基因是不存在的[21-22]。如果内参基因在试验条件下具有相对的稳定性，那么其稳定性存在有限的波动也是可以接受的[23]。因此，在进行qRT-PCR试验前，研究人员应该进行候选内参基因的验证。

目前，关于不同季节黑线姬鼠睾丸内参基因的研究未见报道。本研究以黑线姬鼠睾丸为试验材料，从转录组数据和传统内参基因中筛选出候选内参基因，包括ALDOA（Aldolase， Fructose-Bisphosphate A）、GLUL（Glutamate-Ammonia Ligase）、RABAC1（Rab Acceptor 1）、TEGT（testis enhanced gene transcript）、EID3（tumor protein p63-regulated gene 1）、SYF2（SYF2 Pre-MRNA Splicing Factor）、MRPL20（Mitoch-ondrial Ribosomal Protein L20）、GAPDH（Glyceral-dehyde-3-Phosphate Dehydrogenase）、HPRT（Hypox-anthine Phosphoribosyltransferase）、18s（18SrRNA）、B2M（Beta-2-Microglobulin）、NWD1（NACHT And WD Repeat Domain Containing 1）。本研究通过qRT-PCR技术检测不同季节（春季、夏季、秋季）黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因的表达情况，使用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对候选内参基因进行稳定性分析，并用LDHC（动物睾丸发育过程中的关键酶基因[24]）进行验证，为深入研究黑线姬鼠睾丸的相关基因功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为成年雄性黑线姬鼠的睾丸，捕捉地点为黑龙江省牡丹江市三道关自然保护区。捕捉时间为春季、夏季和秋季，其中春季和夏季为睾丸下降期，秋季为睾丸正常期。将3个季节的睾丸分别进行混合取样，每个季节3次生物学重复，用于分析后续qRT-PCR表达量。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 本研究使用Invitrogen的TRIzol"" Reagent磁珠法试剂盒提取总RNA，操作步骤参照试剂盒说明书。使用Nanodrop2000和Agilent2100对所提RNA的浓度、纯度、核酸质量进行检测。将1 μg总RNA作为反转录模板，使用Vazyme- R123反转录试剂盒合成cDNA，放置在-20 ℃下保存。

1.2.2 候选内参基因的选择及引物的设计 基于实验室黑线姬鼠睾丸转录组数据（未公开），选取ALDOA、GLUL、RABAC1、TEGT、EID3、SYF2、MRPL20、GAPDH、HPRT、18s、B2M、NWD1共12个基因作为候选内参基因。使用Primer6设计候选内参基因的qRT-PCR引物，见表1。引物的退火温度为58 ℃，引物长度范围为17～23 bp，扩增产物长度范围为80～200 bp。引物序列由哈尔滨速灵生物科技有限公司合成。

1.2.3" qRT-PCR反应条件" 本试验采用Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪和FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒进行20 μL体系的qRT-PCR。反应体系：SYBR Green Master 10 μL，cDNA模版1 μL，上下游引物各0.4 μL，加8.2 μL ddH2O 8.2～20 μL。反应条件：95 °C 10 min，95 °C 15 s，58 °C 45 s，40个循环。每个季节3次生物学重复，每个样本3次技术重复。

1.2.4 数据分析 GeNorm[25]通过分析各候选内参基因的Ct值，得出对应的M值（表达稳定性值，expression stability value）并进行排序，预设的临界参数为M=1.5。当Mlt;1.5时，表明该基因稳定性较好，基因表达稳定性与M值呈负相关。NormFinder的计算模式与GeNorm类似，也可以根据候选内参基因的Ct值计算出基因表达的稳定性。此外，NormFinder还可以通过数学模型计算同一样本的组间差异。Bestkeeper[26]可以通过各候选内参基因Ct值的标准差（Standarddeviation，SD）与变异系数（Coefficient，CV），评估基因表达稳定性，其中SD和CV与基因表达稳定性呈负相关。不同软件对同一组数据进行分析时，因其算法不同，计算结果也有所差异，因此需要引入RefFinder[27]进行对GeNorm、NormFinder和Bestkeeper的计算结果进行综合分析，最终得到候选内参基因的综合性排名。

本研究通过qRT-PCR得到的循环阈值（Ct）后，使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper分析12个内参基因在不同季节黑线姬鼠睾丸中表达的稳定性。然后，通过RefFinder对上述3个软件的分析结果进行综合分析，筛选出不同季节黑线姬鼠睾丸中基因表达稳定性最好的内参基因。

1.2.5 候选内参基因的验证" 将不同季节黑线姬鼠睾丸的cDNA作为底物，根据LDHC基因片段，设计qRT-PCR引物（上游引物：GTGGTCGGAGTCGGCAATGT；下游引物：GCTTGGAGTTGGCAGATACACTG），按照1.2.3节中的扩增体系和反应条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 内参基因引物的特异性验证

通过PCR检测内参基因引物的特异性，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，12个候选内参基因均在目标位置扩增出单一条带，见图1。将不同季节黑线姬鼠睾丸的cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR分析。上述结果表明，12个候选内参基因可以用于后续试验。

2.2 候选内参基因的表达丰度分析

Ct值是qRT-PCR扩增过程中达到预设阈值时需要的循环数。Ct值越小，代表模板中目的基因浓度越高，基因丰度越大，可以反映出该基因的表达水平[11，28]。对12个候选内参基因的Ct值进行分析，使用箱线图分析这些基因的表达丰度、波动幅度和稳定性，见图2。结果表明，12个内参基因的Ct值范围为19～34，基因表达丰度广泛。其中，NWD1的Ct值最低，但波动范围较大，数值范围为19.9～27.1；B2M的Ct值波动范围较小，Ct值也相对较低，数值范围为21.7～25.9，表达丰度较大；18s的Ct值波动范围较大，数值范围为27.5～33.9；其他候选内参基因的Ct值数值范围为21.77～33.91，表达丰度适中。

2.3 不同季节黑线姬鼠睾丸内参基因的表达稳定性分析

GeNorm分析结果见表2，不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为GAPDH=18s＞HPRT＞SYF2＞MRPL20＞B2M＞ALDOA＞NWD1＞GLUL＞RABAC1＞TEGT＞EID3；NormFinder分析结果见表2，不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为SYF2＞B2M＞MRPL20＞HPRT＞GAPDH＞18s＞ALDOA＞RABAC1＞GLUL＞NWD1＞TEGT＞EID3；BestKeeper分析结果见表2，不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为EID3＞TEGT＞RABAC1＞B2M＞ALDOA＞SYF2＞MRPL20＞HPRT＞GAPDH＞18s＞GLUL＞NWD1。由于不同软件间的算法差异，候选内参基因稳定排名有所不同，需使用RefFinder对上述软件结果进行综合性分析。不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为STF2＞B2M＞GAPDH＞MRPL20＞18s＞HPRT＞ALDOA＞EID3＞RABAC1＞TEGT＞NWD1＞GLUL，见表2。

2.4 目的基因LDHC的表达分析

乳酸脱氢酶C基因（lactate dehydrogenase C，LDHC）主要存在于动物睾丸、脑和肌肉等组织器官中，在雄性动物睾丸发育过程中发挥重要作用[24]。根据上述4个软件的内参基因稳定性综合分析，以SYF2作为内参基因，通过qRT-PCR检测不同季节黑线姬鼠睾丸中LDHC基因的表达量，结合黑线姬鼠睾丸转录组数据，对其基因表达模式进行分析和验证。由图3可知，LDHC在不同季节中均有表达，其中春季表达量高于夏季和秋季，这与转录组数据一致。

3 讨论与结论

3.1 讨论

黑线姬鼠作为我国常见的农业有害生物，不同季节黑线姬鼠的睾丸形态有所不同，对其繁殖能力影响较大，以往关于其睾丸的研究多以形态学为主[8]，主要是将睾丸的下降率作为一种生态调查内容。目前，转录组学、代谢组学和蛋白组学等多组学技术在动物学中研究较为广泛，其中转录组学可以通过测定和分析基因的差异表达量来揭示动物的器官发育和各类胁迫下的基因调控机制[29-30]，而内参基因作为验证转录组学数据的重要参考，其在不同条件下的表达稳定性就显得尤为重要。李强等[31]通过转录组和代谢组联合分析了黑线姬鼠睾丸下降的功能与机制，其所选用的内参基因就是表达量较为稳定的EID3。理论上，内参基因应该在不同物种、同一物种不同器官、不同条件下均能稳定表达。但实际上，内参基因的稳定性在种间、种内、不同条件下均表现出一定的差异。因此，根据特定条件筛选出稳定表达的内参基因将有利于动物功能基因及其基因家族表达变化特征的后续分析。

目前，关于动物组织及器官内参基因的研究较多。Zhao等[32]选择了17个候选内参基因，研究其在山羊（Capra hircus）棕色脂肪组织（BAT）白化过程中的表达稳定性，结果表明，GAPDH、GABARAP、GLTA、ACTB被确定为稳定的内参基因，可用于山羊BAT白化机制研究。Wang等[33]选择了6个候选内参基因，研究其在鸡（Gallus gallus domesticus）卵巢发育过程中的表达稳定性，结果表明，EEF1A、RPL15是最稳定的内参基因，可用于研究鸡胚胎中卵巢发育及卵母细胞减数分裂的调控机制。Salatiello等[34]选择了4个候选内参基因，研究其在大口黑鲈（Micropterus salmoides）不同组织器官、不同发育阶段、不同试验条件下的表达稳定性，结果表明，CYTB是不同组织器官（脾脏和头肾）和不同发育阶段下的最适内参基因，EF1-α是盐胁迫和生物胁迫下的最适内参基因。本研究筛选出的内参基因SYF2与RNA的剪接密切相关，可能参与了mRNA的前期剪接和细胞周期进程[35]，是可变剪接的组成部分[36]，也是目前研究的热点问题。而黑线姬鼠睾丸下降是一个复杂的生理过程，涉及众多基因、蛋白质和代谢物的变化[31]，可变剪接就是其中一个重要的基因调控过程。因此， STF2可以作为分析其与其他可变剪接基因表达的关联规律及睾丸功能基因鉴定的基础。

3.2 结论

本研究通过NormFinder、GeNorm、Bestkeeper和RefFinder对不同季节黑线姬鼠睾丸中12个候选内参基因的表达稳定性进行系统性分析与评估。结果表明，SYF2的表达稳定性最好，可以作为不同季节黑线姬鼠睾丸的最适内参基因。本研究可作为黑线姬鼠睾丸功能基因表达分析的基础，并为后续黑线姬鼠鼠害的防治和黑线姬鼠试验动物化的研究提供参考。

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