斑马鱼氨基酸检测样品前处理及检测分析流程的优化研究

摘要" 以斑马鱼的氨基酸检测为例，深入探讨了其样品前处理流程、进样浓度确定和程序操作规范，并列举了操作过程中可能出现的常见问题及解决方案，为斑马鱼及类似样品的前处理以及氨基酸检测提供参考。斑马鱼因其体积小、含水量大的特性，在样品称重、粉碎和水解环节均需进一步优化；通过梯度合理设置稀释浓度，可以确定最适进样浓度；严格规范操作程序有助于数据高效采集和处理，从而形成高质量检测报告；同时有效应对试验过程中出现的仪器操作不当、程序设置错误和数据处理偏差等方面的问题，能够显著提升检测效率和结果的精准度。

关键词" 斑马鱼；氨基酸；样品前处理；进样浓度；程序设置

中图分类号" S-3；R446.1"""""" 文献标识码" A"""""" 文章编号" 1007-7731（2024）22-0050-05

DOI号" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.22.011

基金项目 安徽省科技创新战略与软课题研究“依托羚羊工业互联网建设虚拟研发机构路径研究”（202306f01050012）。

作者简介 陈瑞瑞（1987—），女，安徽蚌埠人，硕士，助理研究员，从事中草药和食品检验检测工作。

通信作者 梁伟（1986—），男，安徽合肥人，助理研究员，从事农业科技咨询与管理工作。

收稿日期 2024-08-27

Optimization of sample preprocessing and detection analysis process amino acid detection of zebrafish

CHEN Ruirui""" ZHANG Ying""" WANG Chenchen""" LIANG Wei

（Anhui Promotion Center for Technology Achievements Transfer， Anhui Academy of Science and Technology， Hefei 230031， China）

Abstract" Taking the amino acid detection in zebrafish as an example， this investigation delves into its sample pretreatment process， determination of injection concentration， and procedural operations standards. The common issues that may arise during the process were listed， to provide a reference for the pretreatment and amino acid detection of zebrafish and similar samples. Due to its small size and high water content， optimizations were required for the weighing， crushing， and hydrolysis stages of zebrafish samples. Setting up gradient dilution concentrations could determine the optimal injection concentration. Standardizing the operational procedures was beneficial for the efficient collection and processing of data， and form high-quality detection reports. Additionally， properly addressing issues related to instrument operation， procedure setup， and data processing during the test， which helps to make the testing process， more efficient and the results more accurate.

Keywords" zebrafish; amino acids; pre processing; injection concentration; program setting

氨基酸检测是动植物食品营养[1-3]、临床医学[4-5]、细胞代谢[6-7]以及基因编辑等领域[8-9]常用的一种掌握生物信息的手段。其检测过程可分为样品前处理、仪器进样、在线数据采集和线下数据处理4个部分。不同样品类型和不同仪器的前处理方法和程序操作也不尽相同。斑马鱼因代谢较快在临床医学上常被作为用药载体检测氨基酸代谢[10-11]。该物种因其个体含水量较高且密度有差异，与其他干性固体、血液和植物叶片等样品的前处理不同。样品前处理是检测分析试验中影响结果准确性的关键步骤之一[12]；动物源性食品具有复杂的基质，前处理方法会影响分析技术的准确度、精密度、灵敏度和整体性能[13-14]。仪器使用、程序设置与数据处理等环节是氨基酸检测的难点，陈金珍[15]和陈蕊君等[16]总结了氨基酸检测过程中不同型号氨基酸分析仪的常见故障问题，并提出了相应的解决办法；姜涛等[17] 和王华等[18]优化了氨基酸检测程序，实现氨基酸检测定量化。目前，氨基酸检测程序设置、数据采集和处理鲜有详尽的相关指导。为此，本研究针对氨基酸检测中特殊样品前处理优化、数据采集和处理方法以及仪器使用过程中可能出现的问题及解决办法进行梳理，为一线检测人员提供参考。

1 斑马鱼氨基酸样品材料前处理

1.1 样品称重

陈琛等[12]在检测鸡的胸肌、腿肌、肝脏和肠道组织中的游离氨基酸时，选择将屠宰场冻存的样品取出解冻后称取组织或食糜重量作为最终计算氨基酸含量的参数；修磊等[19]检测水产品中喹乙醇类药物残留时将鱼、虾等肌肉部分取出，除净脂肪和结缔组织，经过简单处理后，匀制成肉糜状后称重。新鲜斑马鱼的含水量在70%以上，新鲜鱼样在运输、匀浆等过程中含水量会发生变化，同一批斑马鱼样品，含水量在72%～76%，此差异可造成氨基酸检测含量存在较大误差。因此，在本试验中先对新鲜样品进行称重（称重之前用吸水纸吸干表面水分），然后在60"℃下烘干处理4"h以上，保证烘干样品达到恒重，再次称重，最后求得鲜重和干重的氨基酸含量，供计算参考。

1.2 样品粉碎

陈琛等[12]在处理鸡各部分组织时，比较了超声波细胞粉碎机和高速匀浆机两种设备，发现前者处理样品的峰值和响应值更高。斑马鱼个体非常小，合适的匀浆机较少，常见匀浆机普遍较大，无法将新鲜斑马鱼样品彻底打碎或可能造成喷溅等。因此，在本研究中将样品烘干后采用一次性研磨棒和圆底离心EP管研磨，利用小型振荡器振荡管底或利用离心机将管壁和管盖上残留鱼粉离心至管底；此外，可以向离心管中倾倒液氮或冷冻离心管等方式辅助研磨，使样品研磨更加彻底。手动研磨耗时耗力，且力度和频率均有所欠缺，可添加海砂（SiO2含量≥99.0%）辅助研磨，检测结果无差异。

1.3 样品水解

1.3.1 水解方式 酸水解是较常用的水解方法，包括盐酸水解、硫酸水解法等[14]。本试验对照国标[20]及其改进方法[21]，结合实验室实际情况对水解方法进行优化：水解管中加入6"mol/L盐酸10～15"mL，抽真空后充氮气，重复3次，在充氮气的状态下封口，110"℃水解22"h，然后用去离子水冲洗定容至50"mL容量瓶中，取1"mL定容溶液于40～50"℃条件下真空干燥，取1～2"mL水溶解后蒸干，对应取1～2 mL pH 2.2的缓冲液溶解过滤，供仪器测定。

1.3.2 水解管选择与赶氧 氨基酸检测水解管一般选择安瓿管、耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管等[22]。李梅等[14]在样品前处理中比较了3种水解管搭配不同密封垫的使用体验和效果，结果显示，螺旋口带盖试管搭配PP材质的密封垫或氟硅橡胶垫的水解效果较好。本研究介绍了2种水解管（图1），左侧是螺旋口带盖试管，右侧是带侧支水解管（两种型号）。研磨样品用6"mol/L盐酸冲洗至水解管中，加入10～15"mL水解液；如选择螺旋口带盖试管，则无需进行抽真空操作，与氮吹仪配合使用，将氮吹仪与氮气瓶连接，调整适当氮气流速，将水解管置于氮吹针下，使针接近液面，以能明显看到液面出现凹坑为宜（图2），持续30"s左右，然后在氮吹环境下拧紧盖子；如选择带侧支水解管，从主盖处加入消解液后拧紧盖子，侧支接至真空泵，再连接至氮气瓶，导入氮气，持续30"s左右，拧紧侧支，关闭氮气瓶。试验证明，两种水解管及其赶氧方式的结果无明显差异，可根据实验室条件选择。

1.3.3 水解和缓冲液 严俊等[23]在检测保健食品中牛磺酸含量时选择用分析纯盐酸配制水解液；姜涛等[17]检测饲料中赖氨酸含量时指出所用试剂级别须为分析纯或优级纯。本试验选用优级纯和分析纯盐酸配制6"mol/L盐酸水解液，两者水解结果无差别，但分析纯试剂性价比更高且易获得。进样时如选用盐酸代替柠檬酸钠配制缓冲液，则建议使用优纯级试剂。

2 进样浓度优化

2.1 检测原理

与多糖、重金属等的检测不同，氨基酸分析无需做标准曲线，采用单标法，具体方法：取2.5"mmol/L氨基酸混合标准品0.2"mL，用pH 2.2的优纯级盐酸定容到5"mL容量瓶中，过滤后仪器默认为2"nmol/20 L标样[23-24]；样品浓度要求控制在0.4～10"nmol/20 L，且与标样浓度接近，如进样浓度太低则结果不准，过高则会堵塞管路。

2.2 进样浓度

探索样品进样浓度时，纯蛋白样品可直接估算，当样品浓度未知时，李梅等[14]研究提出，可采用试验估算法：取2个试管分别加入0.1"mL样品和标准品，再分别加入1"mL茚三酮试剂，在100"℃下加热3"min，于波长570 nm处测定溶液吸光度值，进行比较得出样品稀释或浓缩倍数。赵阳美瑾等[25]研究认为，水产品在运输过程中易发生蛋白质和脂类氧化，造成其品质下降；李银等[26]研究发现，牛肉在解冻过程中蛋白质会发生氧化，导致其品质下降。因此，本研究基于已有相关研究并结合鱼类蛋白质含量和斑马鱼体型较小、均匀性较差等因素，以新鲜的斑马鱼为样品，水解定容至50"mL，取1"mL定容样品蒸干，设置pH 2.2的盐酸10、5和2倍水解液，即第1次用盐酸稀释10倍，仪器自动清洗运行完毕后，观察数值和峰值再决定是否进行第2次稀释，系统默认标样浓度2"nmol/20 L给出响应值或质量，以此为参照确定检测样品的氨基酸含量。检测后若氨基酸含量均在0.4～10.0"nmol/L即暂停（或根据已出数据计算适当的稀释倍数）。试验结果表明，2倍水解液20 L进样量时斑马鱼各氨基酸的含量在0.4～10.0"nmol/L，半胱氨酸（Cys）含量最低，为0.488"nmol/L，甘氨酸（Gly）含量最高，为9.591"nmol/L。

3 仪器运行与程序设置

3.1 仪器运行

严俊等[23]、葛凯靖等[24]总结了L-8900氨基酸检测仪的运行条件，包括离子交换柱和反应柱规格、柱温、缓冲液、茚三酮流速、检测波长、循环数和反应时间等，并与其他氨基酸检测分析仪进行了比较。本试验中，L-8900氨基酸检测仪运行之前先打开仪器和联机电脑，调用在线和离线程序。连接成功以后首先打开在线程序，选择“单次运行”作为开机预热稳定程序，调用方法默认pH 4.6×60-2622（Stand-by）.met，其间2个柱温箱（分离柱和反应柱）均达到指定温度，2个泵均达到指定流速，Stand-by作为单次运行程序。管路B1-4：PH1-4为柠檬酸钠缓冲液，B5为蒸馏水或纯水，B6为PH-RG，以上管路均经过泵1；R1、R2分别为茚三酮溶液和Buffer缓冲液，R3为5%的色谱级乙醇溶液，以上管路均经过泵2。

3.2 检测和数据处理

3.2.1 创建序列 姜涛等[17]和王华等[18]通过更换缓冲液、标准物质以及设置分离程序等手段确定了检测氨基酸的出峰时间和位置，实现氨基酸的快速分离和准确定量。本试验中，进样前在离线程序中创建待测序列，创建方法：点击“创建序列”“采集”，“样品ID”和“日期”跳过，“未知数目”为所测样品数量+2。第一行将样品名和文件名均命名为RG，调用方法pH 4.6×60-2622（RG）.met，第一行不进样，体积为0，样品瓶号随意指定；第二行样品名和文件名分别命名为STD和空白，样品瓶号按实际放置顺序填写，调用方法pH 4.6×60-2622.met（一般默认，可修改）。创建完成后将该序列保存为下拉列表中的“序列”类型，序列可命名为“待运行序列”并保存在当天日期文件夹中。

3.2.2 运行序列 将标样和样品按照创建序列时填写的瓶号依次放进样品盘中，打开在线程序，序列名称为待运行序列，结果路径可选择与“待运行序列”在同一日期文件夹中，结果名称为运行后未处理序列，另存为方法和PDF文件，提交。

3.2.3 矫正序列 运行结束后，打开脱机程序，点击创建序列，调用运行序列方法pH 4.6×60-2622.met，从现有数据文件中选择“未处理序列”，运行后的序列列表选择除RG外需要分析的其他序列，STD一行的处理类型选择清除所有矫正，级别选1。以定容溶液50"mL，取1"mL蒸干，5"mL稀释为例，计算质量分数（%）＝，式中为报告中显示每20 L样品中氨基酸的质量（ng），乘积因子为25，稀释因子为20，对处理后序列做出以上选择后，可另存在同一日期文件夹中，序列名称为“矫正序列”。

3.2.4 处理序列 序列矫正后，选中菜单栏中“处理”，弹出对话框确认并选择，序列名称如E/同一日期文件/矫正处理，结果路径为E/同一日期文件，结果名称为处理后序列。点击“开始”，仪器将自动处理数据。实践发现，需重复此操作一次，不必重新命名，处理后的序列双击，可查看检测结果报告。

3.3 常见问题

3.3.1 仪器操作方面 陈金珍[15]列举了S-433D型氨基酸分析仪温控系统、压力系统等方面出现的故障以及解决办法；胡亮等[27]分析了L-8800氨基酸分析仪的泵压异常和基线不稳等故障，并提出了相应的解决办法；陈蕊君等[16]为L-8900氨基酸分析仪分析柱的重新填充提供了方法。本试验发现，L-8900氨基酸分析仪如果长时间未使用或更换茚三酮溶液后，需对仪器进行鼓泡（purge）30"min，排出管内气体，鼓泡之前先后打开泵1和泵2阀门，鼓泡结束后阀门关闭顺序与打开时相反；自动进样针也可能会出现堵塞，一般火烧进样针即可通畅；更换溶液之前打开N2阀门，为管路降压。

3.3.2 程序设置错误 程序使用按顺序为创建序列并命名为“未运行序列”，调用序列后命名为“未处理序列”，对未处理序列进行矫正，命名为“矫正序列”，处理序列后命名为“处理序列”，以上操作中，一是要清楚每一步的处理节点，二是序列的保存方式和途径不能出错。

3.3.3 数据处理偏差 姜涛等[17]和王华等[18]对氨基酸出峰问题进行了探索，不同仪器各种氨基酸的出峰设置存在差异。本试验按照系统默认的各氨基酸出峰时间，直接处理后发现，个别氨基酸出峰偏离，导致检测数据为0。其原因可能是氨基酸标样放置时间过长。针对这一结果，可以根据实际出峰时间进行修正，具体办法是打开“结果集”，找到“未处理序列”，点击序列出现峰图，根据实际出峰时间，选择“方法”中“峰/组”更改氨基酸出峰时间，点击“分析”确认每种氨基酸均能被准确读出。调整出峰时间后系统自动以更新的设置时间为准，无需保存。在此基础上，可通过两种方法得到准确的氨基酸含量：一是调出“未处理序列”重新处理，二是选中“处理后序列”重新处理，即可按照新的出峰时间更改并覆盖原结果。

综上，样品前处理是氨基酸检测中试验误差的主要来源，控制人为误差，实现样品处理的一致性，是获得客观数据的保障。本研究对斑马鱼氨基酸检测样品前处理进行优化，以L-8900为氨基酸检测仪器，为保证氨基酸检测结果的准确性，在样品前处理的称重、粉碎和消解环节，根据实验室实际条件提出优化操作方法以及进样浓度的控制办法；系统梳理总结了检测程序设置和数据处理方法，以及仪器运作和程序分析中常出现的问题，提升其检测效率和结果的精准度。

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（责任编辑：何" 艳）