加州鲈维氏气单胞菌拮抗菌的筛选

基金项目 湖北省现代农业产业技术体系项目[（2023）-2]。

作者简介 安相茹（1998—），女，河南洛阳人，硕士研究生，从事渔业发展研究。

通信作者 苏应兵（1978—），男，湖北荆州人，硕士，副教授，从事水产动物病害防治研究。

收稿日期 2024-03-13

摘要 为筛选出对维氏气单胞菌（Aeromonas Veronii）有拮抗效果的最优菌株，本试验从湖北荆州太湖加州鲈池塘底泥中分离获得一株细菌C2-1，对其进行全基因组测序，并研究其生防作用机制。结果表明，细菌C2-1为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），具有广谱抑菌性，对希瓦氏菌（Shiva's bacteria）、溶血链球菌（Streptococcus hemolysis）等多种水产病原菌的抑菌直径达18.57～25.28 mm。菌株C2-1具有较高的酸碱稳定性且对温度适应范围较为广泛。扫描电子显微镜镜观察发现细菌C2-1的发酵产物对维氏气单胞菌具有破坏效果。液质联用（LC-MS）分析该细菌包含多种不同的脂肽类活性物质，如伊枯草菌素等。研究发现，贝莱斯芽孢杆菌C2-1是防治维氏气单胞菌的潜力菌株，对维氏气单胞菌具有较好的抑制作用，且应用前景良好。

关键词 维氏气单胞菌；贝莱斯芽孢杆菌；加州鲈；生物防治

中图分类号 S947.9"" 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2024）13-0042-07

Screening of antagonistic bacteria against Aeromonas veronii in Micropterus salmoides

AN Xiangru1""" SU Yingbing1""" ZHOU Yi2

（1College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434000， China;

2College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434000， China）

Abstract In order to select the best antagonistic strain against Aeromonas Veronii， a strain of bacteria C2-1 was isolated from the bottom mud of perch ponds in Tai Lake， Jingzhou， and whole genome sequencing， the biological control mechanism was studied. The results showed that the bacterial C2-1 was found to be Bacillus velezensis， with broad-spectrum antibacterial activity. Its antibacterial diameter against various aquatic pathogens such as Shiva's bacteria and Streptococcus hemolysis ranged from 18.57 to 25.28 mm. The antibacterial substances of strain C2-1 had high acid-base stability and a wide range of temperature adaptation. Electron microscopy revealed that the fermentation products of bacterial C2-1 had a destructive effect on Aeromonas veronii. LC-MS analysis showed that the bacterium contains various lipopeptide active substances， such as imidacloprid. It was found that Bacillus velezensis C2-1 was a potential strain for the control of Aeromonas veronii and had good inhibition effect on Aeromonas veronii.

Keywords Aeromonas veronii; Bacillus velezensis; Micropterus salmoides; biological control

水产养殖产量每年稳步增长，捕捞生产量保持相对稳定[1]，并能在有限的空间内生产大量产品，克服了捕获野生物种的相关限制[2]。水产养殖业作为农业生产的重要组成部分[3-4]，在一定程度上满足了人们对海产品可食用蛋白质和营养素日益增长的需求。海洋水产养殖在经济发展中起着至关重要的作用[5]。水产养殖是较大的动物生产部门之一，消费鱼类中超过50%的鱼来自水产养殖[6]。为了满足日益增长的消费需求，水产养殖逐渐向集约化养殖转变，这在一定程度上可能增加渔业传染病传播风险[7]。部分水产养殖中可能存在过量使用抗生素防治水产疾病的现象，如在水产养殖环境和产品中能检测到部分抗药性基因（ARGs）和抗药性细菌[8-9]，抗生素的使用对水生微生物种群产生较大选择压力[10]，可能对动物和人类健康以及生态安全造成风险[11]。

加州鲈（Micropterus salmoides）是重要的食用鱼类之一，其肉味鲜美，肉质细嫩，营养价值高。为满足市场需求，加州鲈的人工养殖规模不断扩大，规模化养殖在一定程度上增加了加州鲈细菌性疾病的发生概率。常见病原体有维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophial）和温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等。为了控制水产养殖生产所面临的疾病，采取了各种措施。其中，芽孢杆菌是应用较广泛的益生菌之一，被认为是部分鱼类肠道微生物区系中的天然成员。芽孢杆菌广泛存在于陆地环境、水生环境和大气环境中。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是革兰氏阳性好氧菌，菌体呈杆状，能形成芽孢，广泛分布于自然界的水体、泥土和动物肠道[12]；与普通生防芽孢杆菌相似，贝莱斯芽孢杆菌具有溶菌、拮抗和诱导植物系统抗性等作用[13]。张德锋等[12]、Zhang等[14]认为，通过拮抗、竞争作用和诱导系统耐药来抑制病原菌，其中拮抗活性主要依赖于其产生的各种次生代谢物[15]，包括脂肽、聚酮和细菌素等，对水生动物疾病表现出良好的生物防治效果。贝莱斯芽孢杆菌表现出广谱抗菌活性，是各种动植物疾病的重要生防剂[16]。例如，贝莱斯芽孢杆菌对马铃薯赤霉病[17]、莲根腐病[18]和小麦赤霉病[19]等植物病害，以及对嗜水气单胞菌引起的鲫鱼[20]、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）引起的尼罗罗非鱼[21]、哈维弧菌（Vibrio harveyi）引起的杂交石斑鱼[22]和嗜水气单胞菌引起的草鱼[23]等感染，均有明显生防效果。其中，贝莱斯芽孢杆菌FZB42菌株主要用于防治根际细菌和促进植物生长[16]。

本试验从太湖鲈养殖池塘底泥中共分离出8株生防菌分离物，筛选出对维氏气单胞菌表现抑菌活性的菌株C2-1，对其进行全基因组测序，并研究其生防作用机制，为防治水生动物疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株" 病原菌来自长江大学动物科学学院已分离鉴定的维氏气单胞菌（登录号QQ781151），拮抗菌从湖北荆州太湖加州鲈养殖池塘底泥中分离。

1.1.2 培养基" 采用LB液体培养基和LB固体培养基。

1.1.3 主要试剂及仪器" PCR产物纯化试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自深圳华大基因股份有限公司；扫描电子显微镜（VEGA3 SBU），超高效液相色谱仪购自Eppendorf AG；电泳仪购自北京市六一仪器厂生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌的初筛和复筛" 采用打孔法进行初筛，将生长至对数期的维氏气单胞菌无菌滤液80 μL涂于LB固体培养基上，干燥后用打孔器在同一平皿上等距离打4个孔，吸取从底泥中分离的菌株菌液50 μL加入孔中，28 ℃恒温培养24 h，记录抑菌直径，同时对有抑菌圈的分离菌株采用初筛的方法进行复筛；拮抗菌的抑菌谱，同样以初筛的方法处理所有的病原菌。

1.2.2 拮抗菌株的形态观察和分子鉴定" （1）形态观察。将菌株C2-1划线于LB琼脂平板，28 ℃恒温培养48 h，观察其形态、湿润度等，并挑取单菌落，经革兰氏染色后使用显微镜观察菌体。（2）分子鉴定。按照Omega细菌基因组DNA提取试剂盒的步骤操作。将获得的拮抗菌DNA作为模板，采用27F和1492R引物进行扩增，扩增后的PCR产物测序后使用BLAST进行比对分析，利用MEGAX构建发育树。

1.2.3 拮抗菌株对病原菌菌丝生长的抑制作用观察" 通过扫描电子显微镜观察细菌的形态。样品制备方法参考李川北等[24]的方法。

1.2.4 拮抗菌发酵液耐酸碱性及最适温度测定" （1）菌株C2-1耐酸碱性测定。将拮抗菌在28 °C、130 r/min下培养2 d，收集上清液并于4 °C、10 000 r/min下离心20 min。离心后取上清液，经微孔过滤器（0.22 µm孔径）过滤获得C2-1无菌滤液，取无菌滤液按不同pH梯度处理1 h后，调整pH值为7.0，测定发酵上清液的拮抗活性。

（2）菌株C2-1最适温度测定。将拮抗菌按（1）中方法处理后，取无菌滤液分别于30、40、60、80、90和100 ℃恒温水浴1 h后，测定无菌滤液的拮抗活性。

1.2.5 菌株C2-1抑菌物质提取及抑菌活性测定" 抑菌物质提取和色谱分析参考郑通文[15]的方法。

1.2.6 拮抗菌株对加州鲈的保护性评价" 拮抗菌株C2-1和病原菌维氏气单胞菌分别设置106、107和108 CFU/mL浓度梯度。分为3个处理组，1个空白对照组。第一组腹腔注射100 µL（106、107和108 CFU/mL拮抗菌菌液）+100 µL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）的混合液；第二组注射100 µL（106、107和108 CFU/mL 拮抗菌菌液）+100 µL（LB）；第三组注射100 µL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）+100 µL（LB），连续7 d观察并记录加州鲈的状态。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离和筛选

通过对池塘底泥中的多株细菌进行初次筛选和再次筛选，发现一株对维氏气单胞菌具有明显抑菌效果的菌株，命名为C2-1。图1为C2-1株菌的初筛和复筛结果，其抑菌直径分别为（24.32±0.40） mm和（25.28±0.56） mm。

2.2 菌株C2-1的抑菌谱

菌株C2-1对多种病原菌均有拮抗效果，C2-1对维氏气单胞菌抑菌圈直径达（25.28±0.56）mm，对爱德华氏菌（Edwardsiella）抑菌圈直径达（20.11±0.17）mm，对希瓦氏菌（Shiva's bacteria）抑菌圈直径达（21.53±0.21）mm，对溶血链球菌（Streptococcus hemolysis）抑菌圈直径达（23.74±0.26）mm，对嗜水气单胞菌抑菌圈直径达（16.02±0.12）mm，对金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌圈直径达（18.57±0.15）mm。抑菌效果如表1所示。

2.3 菌株C2-1的形态观察和分子鉴定

2.3.1 形态鉴定" C2-1菌株在LB培养基上的菌落较湿润，呈不透明且具有黏性（图2A），其形状接近圆形，表面粗糙并带有凸起。显微镜下观察菌株呈短杆状（图2B）。通过革兰氏染色观察，确认该菌株为革兰氏阳性菌。

2.3.2 分子鉴定" 将菌株C2-1测序序列提交至NCBI数据库进行比对，发现菌株C2-1与贝莱斯芽孢杆菌相似性达到98.88%。通过构建发育树，发现C2-1与贝莱斯芽孢杆菌归为一支（图3），故将C2-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），登录号为OR574410。

2.4 菌株C2-1对维氏气单胞菌丝生长抑制作用

通过扫描电镜观察菌丝特征（图4）发现，对照组菌丝体饱满，而菌株C2-1处理组菌丝体侧端呈现球状褶皱，处理后菌丝扭曲且凹陷。

2.5 菌株C2-1耐酸碱性和最适温度测定

温度升高时，菌株C2-1发酵上清液的抑菌活性出现明显变化。在60 ℃以下，抑菌活性保持较高水平，高于60 ℃时，抑菌活性有所下降。C2-1在pH中性情况下抑菌效果最佳，随pH值的升高或降低其抑菌活性均下降。测定结果如表2所示。

2.6 菌株C2-1抑菌物质的提取

液相色谱-质谱（LC-MS）分析结果显示，C2-1的抑菌物质中包含多种有机化合物。匹配度高的有表面活性素、伊枯草菌素、草菌素、杆菌霉素、多黏菌素B1和多黏菌素B2等。由表3可知，表面活性素的质荷比为1"036.674"3，其出峰时间位于26.93～26.95"min。伊枯草菌素的分子质量的质荷比为1"044.536"0，出峰时间位于21.80～21.81"min。草菌素的出峰时间在21.82～21.83"min，分子质荷比为1"199.641"9；杆菌霉素的出峰时间在30.33～30.34"min，分子质荷比为1"032.524"8；多黏菌素B1的出峰时间在28.60～28.76"min，分子质荷比为1"203.757"2；多黏菌素B2的出峰时间在21.77～21.81"min，分子质荷比为1"189.741"6。

2.7 菌株C2-1对加州鲈的保护性评价

2.7.1 菌株C2-1的拮抗性检验" 腹腔注入100 µL（106、107和108 CFU/mL 的拮抗菌菌液）+100 µL（106、107和108 CFU/mL的维氏气单胞菌液）的混合液，加州鲈死亡率分别为10％、20％和30%。注射100 µL（106、107和108 CFU/mL的拮抗菌菌液）+100 µL（LB）死亡率均为0。注射100 µL（106、107和108 CFU/mL的维氏气单胞菌液）+100"µL（LB），死亡率均为100%。由表4可知，菌株C2-1对加州鲈有较好的保护作用。

2.7.2 病原菌鉴定" 解剖仅注射维氏气单胞菌死亡的鱼，从其肝脏、鳃等部位分离并纯化得到的病原菌，提取病原菌DNA并测序，鉴定方法同1.2.2分子鉴定。鉴定结果显示，病原菌与注射的维氏气单胞菌（QQ781151）系列相似性达99.58%，即分离得到的病原菌为维氏气单胞菌。

3 结论与讨论

本研究从太湖鲈养殖池塘底泥中分离生防菌株，筛选得到一株对维氏气单胞菌表现抑菌活性的菌株，命名为C2-1，其抑菌圈直径达21.62～24.32 mm。菌株C2-1的抑菌物质具有很高的酸碱稳定性和热稳定性；扫描电子显微镜观察发现菌株C2-1的发酵产物对维氏气单胞菌的膜结构具有损坏效果；LC-MC分析表明菌株C2-1包含多种脂肽类化合物，如伊枯草菌素等。该研究结果与程心怡等[25]报道的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）J2-2的无菌滤液对维氏气单胞菌的抑制作用结果相似。通过对菌株C2-1进行形态学观察和分子生物学鉴定，该菌初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。扫描电镜中拮抗菌株作用于病原菌体表面出现的溶解现象，推测是贝莱斯芽孢杆菌产生的抑菌物质如脂肽类抗生素等物质引起[26-28]。

本试验从加州鲈池塘底泥中分离获得C2-1菌株，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，对维氏气单胞菌有明显抑菌作用，其直径可达（25.28±0.56）mm，对希瓦氏菌、溶血链球菌等多种水产致病细菌也有较好的抑制效果。贝莱斯芽孢杆菌可以产生多种脂肽类物质，对鱼类安全可靠，在加州鲈水产养殖中具有较大的应用潜力。

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（责编：何 艳）