多维度评价及优化黄芪瞬时高温灭菌工艺

摘要：为优化黄芪瞬时高温灭菌（high temperature short time，HTST）工艺参数并多维度考察其对黄芪质量的影响，基于指标相关性的权重系数（criteria importance though intercrieria correlation，CRITIC）法采用正交设计优化黄芪灭菌工艺参数，以灭菌温度、灭菌时间、药材粉碎粒度为考察因素，以灭菌率、5种化合物含量及1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）清除率为考察指标，通过直观及方差分析评价灭菌对3个考察指标的影响；并运用液质联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）确认指纹图谱共有峰的结构，以偏最小二乘回归分析法分析共有峰与抗氧化活性的谱效关系。结果显示， 灭菌温度是具有显著影响的因素（Plt;0.05），最佳灭菌工艺参数为灭菌温度（170±2）℃，灭菌时间5 s，粉碎粒度50目；按优化工艺灭菌后的3批样品微生物水平均符合药典规定，5种化合物含量及DPPH·清除率与灭菌前比较无明显变化；灭菌前后指纹图谱相似度均大于0.900；谱效学分析相关性结果与化合物单体抗氧化的试验结果及其结构特点基本一致。综上所述，瞬时高温灭菌对黄芪中微生物具有明显杀灭作用且对其质量无明显影响，表明该方法适用于黄芪药材灭菌。

关键词：黄芪；瞬时高温灭菌；指标相关性权重系数；正交设计；谱效关系

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1049

中图分类号：S377；R284 文献标志码：A 文章编号：1008‑0864（2024）07‑0223‑11

黄芪为豆科植物蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao] 或膜荚黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.]的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[1]。黄芪含有黄酮类、皂苷类、多糖类等多种有效成分[2‑3]。现代药理研究表明，黄芪有增强免疫功能、抗炎、抗氧化、抗感染和减缓衰老等作用[4]，是常用的滋补药材。

中药在贮藏过程中易出现虫蛀、霉变等问题，黄芪每年在贮存过程中因微生物污染导致的霉变损失占5%～10%[5]。在常用的中药灭菌方法中，环氧乙烷灭菌后极易产生溶剂残留[6]；臭氧的强氧化性在灭菌过程中对有效成分有影响[7]；湿热灭菌由于湿热蒸汽含有水分易使中药中的成分发生变化[8]；60Co-γ辐照灭菌会降低有效成分的含量且存在放射线残留[9]。合适的灭菌方法在达到灭菌效果的同时，有效成分的稳定也是选择灭菌方法的重要依据。瞬时高温灭菌（high temperature short time，HTST）最突出的优点是灭菌效果好、时间短、机械化程度强，是中药灭菌手段中具有良好应用前景的技术[10]，但其对中药的质量是否有影响还需进行深入研究。滕宝霞等[5]对5种不同灭菌方式对黄芪中毛蕊异黄酮苷含量的影响进行了研究，但黄芪成分复杂，以一种成分含量衡量药材质量存在局限性。

本研究采用正交设计及指标相关性的权重系数（criteria importance though intercrieria correlation，CRITIC）法优化黄芪瞬时高温灭菌工艺参数，选取灭菌率、5种化合物总含量和1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）清除率作为考察指标，多维度综合评价瞬时高温灭菌对黄芪质量的影响，以期为瞬时高温灭菌技术在黄芪药材加工、贮藏中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪饮片购自吉林省长春市各辖区药房，经吉林农业大学田义新教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。对照品毛蕊异黄酮（RFS-G02101903026）、毛蕊异黄酮苷（RFSG02001902019）、刺芒柄花素（RFS-G01801905020）、芒柄花苷（RFS-M01301904002）和山奈酚（RFSG03311812016），高效液相色谱法（high performanceliquid chromatography ，HPLC）检测纯度均大于98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，美国TEDIA生产；甲酸为色谱纯，北京化工厂生产；DPPH试剂，纯度≥98.5%，上海麦克林生化科技有限公司生产；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

试验用仪器包括LC-15C高效液相色谱仪，日本岛津公司；Waters SYNAPT G2 超高效液相色谱-四极飞行时间质谱联用仪，美国Waters公司；KQ-500E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；BT25S型十万分之一电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；UV-1801紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；FW177 型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；WS-FMD15过热蒸汽瞬时灭菌系统，长春钻智制药有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌样品制备

取黄芪饮片1 800 g，均匀分成3份，分别粉碎成24、50、80目颗粒备用；采用PE自封袋分装成9袋，每袋200 g，按照正交因素水平表（表1）对9袋样品进行瞬时高温灭菌处理，用无菌采样袋收集灭菌后的样品。

1.2.2 瞬时高温灭菌工艺优化

采用正交试验法，根据瞬时高温灭菌的经验及设备参数的控制范围，选取灭菌温度、灭菌时间和粉碎粒度为考察因素，每个因素设3个水平，因素水平见表1。以灭菌率、5种化合物总含量及DPPH·清除率为考察指标，CRITIC法综合评价优化黄芪瞬时高温灭菌工艺参数。

1.2.3 正交试验方法

按照 L9 （ 34 ） 正交试验设计表的条件进行灭菌处理，1～9号为正交试验9组样品，10号为未灭菌样品。测定菌落总数等微生224物水平、5种化合物总含量和DPPH·清除率[11]。

1.2.4 微生物限度检查

分别取不同批次灭菌前后样品各10 g，加入pH 7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，混匀即为1∶10（g·mL-1）供试液，依次进行10、100、1 000倍系列稀释。需氧菌总数、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌和沙门菌及耐胆盐革兰阴性菌检测按照2020 年版《中华人民共和国药典（四部）》[12]（以下简称《药典》）通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法操作，并计算灭菌率[13]。

样品菌落总数=样品细菌菌落总数+霉菌及酵母菌菌落总数（1）

灭菌率=（未灭菌样品菌落总数-灭菌样品菌落总数）/未灭菌样品菌落总数（2）

1.2.5 HPLC法测定5种化合物含量

①对照品溶液的制备。分别精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素、芒柄花苷、山奈酚5种对照品各5 mg，置于10 mL的量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含量为0.5 mg·mL−1混合对照品母液。再精密吸取对照品母液1 mL至10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.05 mg·mL-1的混合对照品溶液。

②供试品溶液的制备。分别精密称取黄芪粉末1.25 g，加25 mL 70%甲醇回流提取2次，每次1 h，合并滤液，蒸干，残渣加70%甲醇使溶解，转移至25 mL 量瓶中，用70% 甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

③色谱条件[14]。色谱柱为Agilent色谱柱（HCC18，4.6mm×250 mm）；总流速为1.0 mL·min-1；柱温40 ℃，检测波长280 nm，进样量10 μL；流动相为乙腈-0.2%甲酸水；二元梯度洗脱条件见表2。

④含量测定。分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定峰面积按下列公式计算化合物含量。

式中，A 样为样品峰面积； A 对为对照品峰面积； C 对为对照品质量浓度，mg·mL-1； V 供为供试品进样体积，μL；V 对为对照品进样体积，μL； V 供定为供试品定容体积，mL；W 供为供试品称量，g。

1.2.6 DPPH·抗氧化活性测定

取1.2.5中的供试品溶液适量，加入70%甲醇配制成质量浓度分别为7、6、5、4 g·L-1的系列质量浓度。精密称取对照品毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、山奈酚适量，加入70%甲醇使溶解，配制成50、100、150、200 μg·L-1的系列质量浓度[15‑16]。参照王存琴等[17]方法，在紫外-可见分光光度计518 nm波长下分别测定空白样品溶液（A空白样品）、DPPH·对照溶液、对照样品溶液（A对照样品）及样品溶液（A样品）的吸光度，按下列公式计算自由基清除率。

1.2.7 基于CRITIC法的最佳灭菌工艺优化

根据1.2.4、1.2.5、1.2.6得到的数据，通过 SPSSAU 软件将数据进行归一化处理并进行 CRITIC分析，确定各指标权重系数，根据权重系数计算综合评分[18]，以综合评分进行直观分析及方差分析优化灭菌工艺。

综合评分= Ai/Amax × 权重系数+ Bi/Bmax ×权重系数+Ci/Cmax × 权重系数（5）

式中，Ai为5种化合物含量；Amax为A组内最高值；Bi为DPPH·清除率；Bmax为B组内最高值；Ci为灭菌率；Cmax为C组内最高值。

1.2.8 HPLC指纹图谱的建立

按最佳灭菌工艺处理10 批样品（S1～S10）。按1.2.5 中对照品、供试品溶液制备方法及色谱条件操作测定，导入数据生成指纹图谱及对照指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）处理[19]。

1.2.9 液质联用技术（liquid chromatography-massspectrometry， LC-MS）确认共有峰的结构

质谱条件：高分辨Q-TOF ESI源；正负离子检测模式；样品锥电压35 V；喷雾电压正离子3 000 V；负离子2 400 V；源温150 ℃；去溶剂气为氮气；温度300 ℃；流速300 L·h-1。

1.2.10 谱效关系分析

采用 SIMCA-P 14.0 软件中偏最小二乘回归分析模块对黄芪指纹图谱及DPPH·清除率进行相关性分析，以指纹图谱中各峰的峰面积为自变量（X），以黄芪提取物DPPH·清除率为因变量（Y），计算标准化回归系数和变量重要性投影值（projection valueof variable importance，VIP）。

2 结果与分析

2.1 正交试验黄芪微生物水平考察

微生物水平考察结果见表3，灭菌前需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均超过《药典》[12]规定的微生物限度标准，分别为105、104 CFU·g-1；灭菌后，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均小于灭菌前， 瞬时高温灭菌对黄芪中微生物具有明显杀灭作用，灭菌后黄芪中微生物数量符合《药典》[12]规定。大肠埃希菌、沙门菌和耐胆盐革兰阴性菌在灭菌后均未检出。由此可见，瞬时高温灭菌技术是一种有效降低黄芪中微生物含量的方法。

2.2 黄芪DPPH·自由基清除率分析

由表3可知，瞬时高温灭菌正交试验9组样品DPPH·自由基清除率分别为52.29%、62.89%、67.79%、53.96%、57.95%、60.20%、58.88%、55.53%、59.01%，表明灭菌温度、灭菌时间、粉碎粒度对黄芪抗氧化性均无明显影响。

2.3 黄芪5 种化合物含量分析

5种化合物含量测定结果如表4所示，可以看出，灭菌温度、灭菌时间、粉碎粒度对5种化合物含量均影响不大，其中，3号样品的化合物总含量最高，为0.155%。

2.4 正交试验综合评分结果分析

通过 CRITIC 分析，确定指标A（5 种化合物含量）的权重为23.69%，B（DPPH·清除率）的权重为26.42%，C（灭菌率）的权重为49.88%，根据权重系数采用公式（5）计算综合评分。由表5、表6 可知，各因素作用主次顺序为粉碎粒度gt;灭菌温度gt;灭菌时间，方差分析表明灭菌温度是有显著影响的因素，确定最佳灭菌工艺为灭菌温度170 ℃，灭菌时间5 s，粉碎粒度50 目。分别进行灭菌率、5 种化合物总含量以及DPPH·清除率的直观分析及方差分析，灭菌温度对灭菌率具有显著影响，其他因素对灭菌率无显著影响，灭菌温度、灭菌时间及粉碎粒度对5 种化合物总含量以及DPPH·清除率均无显著性影响（表6）。

2.5 最佳工艺参数验证

以最佳灭菌工艺条件处理3批样品，进行微生物水平测定，结果见表7。灭菌前后样品中5 种化合物总含量及DPPH·清除率测定结果见表8，结果经t 检验均无显著性差异（Pgt;0.05），见表9。样品中5种化合物总含量与DPPH·清除率均未发生明显变化。需氧菌含量低于105 CFU·g-1，霉菌和酵母菌含量低于103 CFU·g-1，微生物水平均符合《药典》[12]规定，表明该工艺合理可行，具有可操作性。

2.6 灭菌处理后黄芪指纹图谱分析

结合DAD检测器检出色谱峰的紫外谱图，以未灭菌样品（S11）指纹图谱为参照，经Mark峰比对，确定了13 个共有峰（图1）。经计算，S1～S11号样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.945、0.942、0.915、0.947、0.951、0.945、0.948、0.921、0.955、0.969、0.939，灭菌后黄芪样品与对照指纹图谱相似度均在0.900以上，表明灭菌后样品质量稳定。

2.7 基于LC-MS 对13 个共有峰的结构确认

基于黄芪质谱正负总离子流图和5种对照品正负离子流图，根据相关数据库NCBI 检索、文献[20‑21]对比及5种对照品质谱裂解碎片信息对得出的13个共有峰进行结构推断，确认均为黄酮类化合物，结果如表10。

2.8 灭菌处理黄芪DPPH·清除率测定结果

S1～S10样品质量浓度为7 g·L-1时， DPPH·清除率分别为54.96%、61.87%、60.79%、56.68%、63.07%、62.35%、58.50%、57.47%、58.92%、60.88%。

2.9 黄芪中5 种单体化合物DPPH·清除率测定结果

5 种化合物均为黄酮，各单体质量浓度为150 μg·L-1 时，DPPH·清除率从大到小依次为山奈酚（86.15%）、毛蕊异黄酮（65.76%）、毛蕊异黄酮苷（25.63%）、刺芒柄花素（16.68%）、芒柄花苷（16.68%）。

2.10 谱效关系分析

以10个指纹图谱中13个共有峰的峰面积为自变量（X），与其对应的DPPH·清除率为因变量（Y），导入SIMCA-P 14.1软件中，作偏最小二乘回归分析模型拟合，变量重要性投影值（VIP）和偏回归系数见图2。VIP值由大到小的顺序依次为山奈酚、毛蕊异黄酮-7-0-葡萄糖-6\"-0-丙二酸盐、汉黄芩素/千层纸素、异鼠李素、毛蕊异黄酮-葡萄糖-丙二酸盐异构体、鼠李柠檬素（VIPgt;1），均与DPPH·清除率呈正相关，说明黄芪中上述成分含量增加时DPPH·清除率会提高。

3 讨论

瞬时高温灭菌技术因其温度高、时间短，可以在杀灭微生物的同时更好保留食物的营养，多用于食品行业[22]。目前，此方法用于中药灭菌的报道较少，袁武会[23]研究表明，参术止带糖浆采用高温瞬时灭菌法，既能有效杀灭微生物又能最大限度保证其质量；李振豪等[24]研究表明，瞬时高温灭菌在彻底杀灭白术、木香及牛黄中的致病菌时，不会改变其中天然成分的完整性。本研究以DPPH·清除率为指标评价瞬时高温对黄芪抗氧化活性的影响，结合指纹图谱，利用谱效关系分析评价高温瞬时灭菌对黄芪药材质量的影响，为高温瞬时灭菌技术在黄芪药材贮藏中的科学应用提供依据。

滕宝霞等[5]通过考察不同的灭菌方式对黄芪质量的影响发现，几种灭菌方式均会影响黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。本研究通过直观及方差分析发现，瞬时高温灭菌能有效降低黄芪的微生物水平，且灭菌温度越高，样品微生物水平越低，而灭菌温度的变化对其中5种化合物含量及DPPH·清除率均无明显影响。最佳工艺灭菌后3批样品与灭菌前比较，5种化合物总含量增加，DPPH·清除率升高，可能与灭菌后水分减少从而使化合物相对含量增加有关。张婷等[25]研究也表明，瞬时高温灭菌后的苦丁茶冬青的有效成分相对含量增加，这与本研究结果一致。可见，瞬时高温灭菌技术适合黄芪药材灭菌。

姚静等[26]通过高效液相色谱-电喷雾检测利用指纹图谱结合化学计量评价黄芪质量，采用对照品分析确认了其中10个色谱峰的归属。本研究利用LC-MS联用技术对共有峰进行了定性分析，确定了13个共有峰的结构，且以抗氧化活性为指标，进行了谱效关系研究，结果表明多数成分抗氧化活性呈正相关，相关性与化合物结构特点基本一致。

本研究同时进行了5种对照品单体的抗氧化活性测定，抗氧化活性效果从大到小依次为山奈酚、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷，芒柄花素、芒柄花苷，与谱效学分析相关性结果及化合物结构特点基本一致。其中山奈酚的抗氧化活性最强，与其分子结构中酚羟基基团较多相关；毛蕊异黄酮有2个酚羟基，抗氧化活性次之；毛蕊异黄酮苷与芒柄花素都有1个酚羟基，但毛蕊异黄酮苷C3位上的酚羟基活性高于芒柄花素C7位上的酚羟基，所以毛蕊异黄酮苷的抗氧化性强于芒柄花素，结果与陈星宇等[27]借助于密度泛函理论分析黄酮类化合物构效关系的结论基本一致，即黄酮类化合物结构中的酚羟基是发挥抗氧化作用的主要活性基团，毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷分子的葡萄糖苷上虽然也有酚羟基，但未表现出强抗氧化性，由此可推断抗氧化活性的强弱取决于化合物中酚羟基的数量及位置，糖苷上的羟基不具有抗氧化活性。

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基金项目：吉林省科技发展计划项目（20200404092YY）；吉林省发展和改革委员会项目（2020C032-6）。