河北省唐秦地区蛋鸡致病性大肠杆菌耐药及毒力检测

摘 要：为了解河北省唐秦地区蛋鸡大肠杆菌病流行情况，对来自河北省唐山市和秦皇岛市部分地区的92株蛋鸡致病性大肠杆菌分离株的血清型、毒力基因、耐药性及生物被膜形成能力进行检测，结果显示：分离的92株大肠杆菌共分为11种血清型，优势血清型为O78（62/69.57%）、O45（30/32.61%）、O2（20/21.74%）；分离菌株毒力基因检测16种毒力基因的携带情况，未检测到iutB、Ler、eaeA2毒力基因。分离菌株耐药基因检测25种耐药基因的携带情况，KPC、CMY-2、

Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB qnrC、qnrD、ermA、mefA基因均未检出；对林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素耐药严重，对环丙沙星、大观霉素敏感；92株大肠杆菌中，强形成膜能力的菌株有46株（50％），中形成膜能力的菌株有24株（26.09％），弱形成膜能力的菌株有12株（13.04％），不形成生物被膜的菌株有10株（10.87％）。本试验结果为河北秦皇岛地区和唐山地区蛋鸡大肠杆菌病防治提供了科学根据。

关键词：蛋鸡；大肠杆菌；血清型；毒力基因

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）09-0014-12

收稿日期：2024-02-29

近几年来，随着我国蛋鸡养殖业的迅速发展，大肠杆菌病的发生呈不断上升趋势，给蛋鸡养殖业造成了很大损失。近几年，有关蛋鸡大肠杆菌病的报道较多，但其分子流行病学报道较少。蛋鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌（Escherichia coil， E. coil）引起的一种疾病，可引起雏鸡、青年鸡、成年鸡的多种症状[1]，引起腹膜炎、输卵管炎、大肠杆菌性败血症、肿头综合征、气囊炎、心包炎、肝周炎[2]等特征性病症。在合适的外部环境下，细菌都有能力形成生物被膜，这被认为是细菌自我保护的一种适应恶劣环境的方式[3]。此外，细菌的毒力和耐药性与其生物被膜的形成能力也有一定的关联 [4]。

本试验对2023年从河北省秦皇岛市和唐山市地区分离的92株蛋鸡致病性大肠杆菌进行血清型、毒力基因及耐药性检测、生物被膜形成能力检测，从而有助于科学防控蛋鸡大肠杆菌病，保障禽畜业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2023年从河北省秦皇岛市和唐山市地区不同养鸡场分离鉴定的92株蛋鸡致病性E.coli，由河北省预防兽医学重点实验室保存。E.coli质控菌株ATCC25922由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器

麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、2×MasterMix、DL-2000Marker，购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖，购自西班牙Biowest公司；头孢噻肟、庆大霉素等14种药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；ID32E肠杆菌科生化鉴定试纸条，购自生物梅里埃中国有限公司。

1.3 细菌分离纯化与鉴定

将疑似大肠杆菌感染病/死蛋鸡进行解剖，将患病蛋鸡的肝、肾、心脏和脾脏等组织处理后无菌划线接种于麦康凯（MAC）培养基，倒置37 ℃恒温培养12 h后，观察菌落形态和生长特性；挑选MAC培养基上桃红色边缘整齐的单菌落接种于伊红美蓝平板，倒置37 ℃恒温培养12 h，观察菌落形态和生长特性；挑选伊红美蓝培养基上紫黑色有金属光泽的单菌落在普通琼脂平板上进行纯化培养，并对纯化后的单菌落进行革兰氏染色镜检，并接种于LB液体培养基中37 ℃培养12 h后，按照生化鉴定试纸条说明书进行生化鉴定。收集剩余的纯化菌株，-20 ℃冻存备用。

1.4 细菌16S rRNA PCR鉴定

水煮法制备DNA模板：将纯化好的菌落在LB液体培养基中进行培养，摇床培养12 h（温度为37 ℃），将菌液10 000 rpm/min离心2 min，弃上清，取1 mL高压后的PBS溶液入到菌体沉淀中，冲悬沉淀，再经10 000 rpm/min离心 2min，弃上清，留沉淀，反复洗涤 2～3次，取200 μL 高压后的PBS溶液将菌体吹悬起来，100 ℃煮沸10 min，在冰上放置2 min，10 000 rpm/min离心 2 min后收集上清，即为所提取的 DNA，-20 ℃冰箱保存备用。

参照文献[5]设计引物，PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共34个循环；72 ℃延伸5 min。取5 μL扩增产物加入1%琼脂糖凝胶样孔中，一个样孔中加入5 μL的PCR产物，设置电泳电压为120 V，电泳时间30 min，将凝胶放入凝胶成像仪中观察条带并拍照。引物合成及PCR产物测序均在上海生工生物工程有限公司进行。

1.5 大肠杆菌血清型检测

1.5.1 DNA模板的制备 操作方法同1.4中水煮法DNA提取。

1.5.2 PCR反应及电泳 参考文献[6]，采用PCR方法对大肠杆菌O抗原进行检测，反应体系如下，2×Taq PCR Mastermix 10 μL，DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，超纯水6 μL。94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min，共34个循环；72 ℃延伸5 min。取PCR产物5 μL加入到1.5%琼脂糖加样孔中，120 V电泳30 min，结果在凝胶成像仪下拍照并记录结果。

1.6 分离菌株的毒力基因检测

参考文献[7]，由北京生物工程有限公司合成毒力基因16对引物。以提取的DNA为模板，采用PCR方法进行毒力基因的检测。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52～66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.7 药物敏感性试验方法

对分离的92株蛋鸡致病性E.coli采用了美国临床检验标准委员会CLSI（Clinicaland Laboratory Standards Institute）推荐的K-B药敏纸片法进行试验，对分离菌株的试验结果进行整理，分析其耐药性。

1.8 细菌耐药基因的PCR检测

参考文献[8]，由上海生工生物工程有限公司合成25种耐药基因引物。以提取的基因组DNA为模板，采用PCR方法进行检测。

1.9 细菌的生物被膜形成能力检测

参考文献[9]，采用结晶紫微孔板法对唐秦地区临床分离到的92株蛋鸡源大肠杆菌分离株进行被膜形成能力测定。判定标准以阴性对照OD590 平均值加3倍标准差定义为ODc，将菌株生物被膜形成能力分为4类：生物被膜无形成能力，OD590 lt;ODc；生物被膜形成能力弱，ODclt;OD590 lt;2ODc；生物被膜形成能力中，2ODclt;ODOD590 lt;4ODc；生物被膜形成能力强，OD590 ≥4ODc。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定

从采集的211份病料中对分离菌株进行分离纯化、染色镜检、生化鉴定。结果显示，分离到了92株菌株，分离率为43.60%。革兰氏染色，在显微镜下观察菌株的形态呈两端钝圆的红色短杆状，在麦康凯平板上呈桃红色、表面光滑、边缘整齐的单菌落（图1）；在伊红美蓝培养基上生长形态为紫黑色并有金属光泽菌落（图2），培养基上的菌株特征与E.coli特征符合。镜检菌株呈红色短杆状，未观察到芽孢，属于革兰氏阴性菌（图3）。92株分离菌株经ID32E肠杆菌科生化鉴定试纸条鉴定分析，评定结果均符合E.coli生化鉴定标准，符合率为99.60%～99%。

2.2 细菌的生化鉴定

分离菌株经生化鉴定后，分离的92株致病性菌株能够将麦芽糖、葡萄糖乳糖、果糖等发酵，V-P试验、尿素酶反应均为阴性，M.R试验为阳性。菌株鉴定结果与E.coli生化特性相符。

2.3 分离菌株16S rRNA PCR鉴定

92株分离菌株经PCR扩增后，在约1 500 bp位置上出现清晰的条带。分离菌株测序结果与GenBank数据库中登录的E.coli的参考株基因序列进行比对，同源性在98.8%～99.9%之间，结果表明92株分离菌株均为E.coli。部分菌株的PCR结果见图4。

2.4 分离菌株血清型检测

对初步分离确定的92株致病性E.coli通过PCR技术进行O血清型检测，共分为11种血清型，分别为O1、O2、O5、O6、O9、O18、O45、O65、O78、O91和O157。由表1可知，62株大肠杆菌血清型为O78，比例为69.57%；O45、O2和O1血清型分离菌株分别是30株、20株和14株，比例分别为32.61%、21.74%和15.21%，为优势血清型；O6、O9、O18、O45、O91和O157血清型大肠杆菌菌株数量较少，见表1。未检出O5、O65血清型，见图5。

2.5 分离菌株毒力基因检测结果

通过PCR方法检测16种毒力基因的携带情况，结果显示，92株致病性E.coli携带13种不同毒力基因，未检测到iutB、Ler、eaeA 3种毒力基因（图6）。92株致病性E.coli中irp2毒力基因检出率最高，为97.83%（90/92）；其次为ompT、fimC和hlyF毒力基因，检出率也较高，均为93.48%；iroN、iucD、Iss和fyuA的检出率在58.70%～91.30%之间，而Vat、astA毒力基因检出率较低，分别为10.87%和21.74%（表2）。

图7为多重毒力基因检测结果。由图7可知，92株致病性E.coli携带5～13种毒力基因不等。其中，有2株携带5种毒力基因，占比2.32%；携带11种毒力基因的菌株数量高达36株，占比41.86%。92株致病性E.coli主要携带毒力谱见表3。由表3可知，含有（hlyF+Colv+Tsh+ompT+Iss+iroN+fimC+iucd+iutA+irp2+fyuA）毒力基因的毒力谱检出率最高，占比32.56%；其次是含有（hlyF+Colv+fimC+Tsh+ompT+Iss+iroN+Iucd+iutA+irp2）毒力基因的毒力谱，检出率为11.63%；第三是含有（astA+hlyF+Colv+fimC+Tsh+ompT+Iss+iroN+iucd+iutA+irp2）毒力基因的毒力谱，检出率为6.98%；含有（hlyF+Colv+fimC+ompT+iroN+iucd+iutA+irp2）和（Tsh+ompT+Iss+iroN+iucd+iutA+Vat+astA+hlyF+Colv+fimC+irp2+fyuA）毒力基因的毒力谱，检出率均是4.65%。

2.6 92株禽致病性E.coli耐药性检测结果

由表4可知，92株禽致病性E.coli对林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素耐药率较高，均在84.78%以上；对头孢曲松、链霉素、红霉素、头孢噻肟、恩诺沙星的耐药率在50.00%～60.87%之间；对氟苯尼考、庆大霉素、恩诺沙星、环丙沙星的耐药率在30.43%～56.52%之间；而大观霉素、耐药率较低，在19.57%。

分离菌株多重耐药结果见图8。由图8可知，2023年分离的92株菌最少耐2种药物的有2株，占比2.17%；最多耐14种药物的有2株，占比2.17%；对7、10种药物耐药的菌株最多，为14株，占比均为15.22%。

2.7 分离的92株禽致病性E.coli耐药基因检测

通过PCR方法对唐秦地区分离的92株E.coli的25种耐药基因进行检测，部分阳性菌株的PCR结果见图9。

92株鸡源致病性E.coli耐药基因检测结果见表5。由表5可知，检出耐药基因以gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5为主，检出率均在93.48%以上；Sul-3、Sul-1、aadA2、Tet（E）、StrA、ermB、StrB耐药基因的检出率分别为34.78%、52.17%、54.35%、56.52%、65.22%、86.96%、89.13%，而KPC、CMY-2、Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、ermA、mefA耐药基因均未检出。

由图10可知，分离的92株E.coli存在多重耐药基因携带情况，携带10种耐药基因的菌株数最多，为30株，占比32.61%；其次，携带9种耐药基因的菌株数为22株，占比23.91%；携带7、11种耐药基因的菌株数都是12株，占比13.04%；携带6种耐药基因的菌株数有6株，占比6.52%；携带8、12种耐药基因最少，都是4株，占比4.35%。

2.8 92株禽致病性E.coli生物膜形成能力检测结果

河北省秦皇岛市和唐山市分离的92株大肠杆菌中，能形成生物膜的有82株，占全部菌株的为89.13%。其中，有46株菌株形成膜能力强，有24株菌株形成膜能力中等，有12株菌株生物被膜形成能力弱，有10株菌株不形成生物被膜，分别占比50.00%、26.09%、13.04%和10.87%。

2.9 生物膜形成能力与耐药性相关性分析

生物膜形成能力与耐药性相关性分析结果见表6。由表6可知，分离的92株大肠杆菌生物被膜形成能力与头孢曲松、头孢噻肟、红霉素、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、氟苯尼考、庆大霉素9种抗生素的耐药性符合率为91.7%～100.0%，分离的92株大肠杆菌生物被膜形成能力与阿莫西林、链霉素、氟苯尼考、复方新诺明、林可霉素、氨苄西林5种抗生素的耐药性符合率为78.9%～90.9%。

3 讨论

3.1 唐秦地区蛋鸡致病性E.coli的血清型分析

不同地区流行的血清型有所不同，致病能力也有所差异。杨文文等[10]对分离的150株大肠杆菌菌株进行O抗原血清型鉴定，其中131株可以鉴定出血清型，其中O78和O1阳性率最高，分别为16.8%和15.3%。王瑶等[11]对江苏、安徽、河南、山东等地区分离的210株大肠杆菌进行O抗原血清型，主要流行血清型为O78、O2、O1，分别占比44.76%、24.29%、13.33%。赵素华等[12]对皖北地区分离的36株大肠杆菌进行血清型鉴定，显示主要流行的血清型为O78、O18、O88，分别占比29.03%、22.58%、16.12%。杨立军等[13]对福建省龙岩市分离的139株大肠杆菌分离株鉴定血清型，优势血清型为O78、O2、O1，阳性率分别为10.0%、10.0%、8.0%。本试验对河北地区秦皇岛市和唐山市92株E.coli进行血清型鉴定，发现84株定型，8株未定型，其中优势血清型为O78、O45、O2，分别占比69.57%、32.61%、21.74%。相关研究表明，蛋鸡致病性E.coli的优势血清型与地区存在一定相关关系。

3.2 唐秦地区蛋鸡致病性E.coli的毒力基因分析

通过检测禽致病性大肠杆菌携带的毒力因子来判断其对机体的致病能力，毒力因子是直接导致禽大肠杆菌病发生的基础。陈亚强等[14]对重庆地区分离的286株禽致病性E.coli的9种毒力基因进行检测，结果表明iss、iucD、hlyF、irp2检出率较高，分别为75.52%、69.58%、52.10%、46.50%。陈祥等[15]对江苏等20个地区分离的243株禽致病性E.coli的13种毒力基因进行检测，结果iss、tsh、iucD、irp2、fyuA的检出率分别为79.4%、68.7%、67.1%、67.1%、66.7%。胡林等[16]对华东部分地区77株禽致病性E.coli进行26个毒力基因的检测，结果fimc、ompa、iss毒力基因的检出率超过75%，未检出hlyF毒力基因。李丽丽等[17]对江苏、安徽、河南、山东等地区分离的210株禽致病性E.coli进行16种毒力基因检测，结果表明fimc、iss、iroN、iucD、fyuA检出率较高，分别为90.00%、79.05%、69.05%、65.24%、50.48%；含有多种毒力基因的禽致病性E.coli分离株有207株，其中含有5种毒力基因最多，占比98.57%，其次是含6、7、8、9种毒力基因的菌株分别占比91.90%、82.38%、72.86%。本试验对从河北地区秦皇岛市和唐山市分离的92株禽致病E.coli的16种毒力基因检测，结果表明irp2、ompT、fimC、hlyF毒力基因的检出率最高，分别为97.83%、93.48%、93.48%、93.48%；含有11种毒力基因的致病性E.coli最多，占比41.86%；其次是含10、8种毒力基因的菌株，占比分别为20.93%、11.63%。由上述结果可知，不同地区蛋鸡致病性E.coli的毒力基因的流行趋势有所不同。

3.3 唐秦地区禽致病性E.coli的耐药基因分析

禽致病E.coli产生耐药性一般是由携带的耐药基因导致的，不同地区分离的禽致病性E.coli携带的耐药基因也有所不同。王永亮等[18]对66株大肠杆菌耐药基因检测，对喹诺酮类药物检测的基因型以qnrA为主，占比50.0%；对氨基糖苷类以aadD为主，占比36.4%。张济培等[19]对广东地区分离的149株水禽源大肠杆菌，对氨基糖苷类药物进行检测，结果表明检测基因型以aadA1为主，占比84.6%。张海龙[20]分离的76株致病性E.coli的gyrA检出率高达100%，其次为Oxa-5、StrB、Sul-2、aadA1，检出率均在78.95%以上。本试验结果表明，对92株禽致病性E.coli进行耐药基因检测，包括β－内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类药物等25种耐药基因，检测到gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5、StrA、StrB、ermB、Sul-1、Sul-3、Tet（E）、Sul-1、aadA2、Sul-2等13种基因。本试验分离的92株禽致病性E.coli以gyrA、aadA1、dhps、Oxa-5耐药基因为主，检出率在93.48%以上，而KPC、CMY-2、Oxa-1、SHV、Tet（C）、Tet（G）、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、ermA、mefA基因均未检出。与上述研究者的结果存在部分不同，不同地区耐药基因的检测结果有所差异，分析认为携带的耐药基因不同，可能与动物的品种与地区有关。

3.4 唐秦地区禽致病性E.coli的耐药性检测分析

禽致病性E.coli在防控过程存在复杂的耐药性以及耐药多重性。潘玉善等[21]对河北、山东、河南、四川、江西、浙江等8省12个地区分离的20株禽致病E.coli分离株进行耐药性检测，结果发现20株禽E.coli分离株对氨苄西林、头孢曲松、头孢头孢噻肟耐药率高达100%，对庆大霉素耐药率为35%，对氟苯尼考耐药率为60%。魏清宇等[22]对从山西省北部地区分离的81株鸡大肠杆菌菌株进行耐药性检测，结果发现对四环素耐药率为92.3%，对恩诺沙星、阿莫西林的耐药率分别为87.7%、84.0%，对链霉素、复方新诺明耐药率分别为77.8%、76.5%，对氟苯尼考、庆大霉素、环丙沙星和头孢噻肟的耐药率分别为55.6%、43.2%、34.6%和9.8%。崔笑博等[23]对山东泰安周边部分地区分离的78株禽致病E.coli进行耐药性检测，结果表明对红霉素耐药率96.2%，对氨苄西林耐药率为92.4%，对环丙沙星耐药率为82.27%，对链霉素耐药率为74.68%，对复方新诺明耐药率为91.1%，对氟苯尼考耐药率为89.8%，对庆大霉素耐药率为72.15%。陈涛等[24]对山东部分地区的试验中发现，家禽大肠杆菌普遍存在多重耐药菌株，占所有耐药菌株的50%以上，且日益增长。2重、3重耐药菌株呈现下降趋势，而5重、6重、7重耐药菌株占比较多。董向磊等[25]对江苏省部分地区（南通、常州和泰州）和山东省胶东地区（烟台、青岛）分离的154株大肠杆菌耐药性检测，结果显示均表现出多重耐药性，最少耐5重，13重耐药菌株最多，占全部菌株的19.48%；其次为12重，占全部菌株的16.88%；10重以上耐药菌株达69.48%。本试验中，92株大肠杆菌对林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明、四环素耐药率较高，均在84.78%以上；对头孢曲松、链霉素、红霉素、头孢噻肟、恩诺沙星的耐药率在50.00%～60.87%之间，对氟苯尼考、庆大霉素、恩诺沙星、环丙沙星的耐药率在30.43%～56.52%之间；大观霉素、耐药率较低，在 19.57%。其中，最少耐2种药物的有2株，占比2.17%；最多耐14种药物的有2株，占比2.17%；最多耐7、10种药物的有14株，占比15.22%。试验结果显示蛋鸡致病性E.coli耐药性严重，不合理使用抗菌药会导致耐药性越来越严重，根据地区的不同其耐药性也有所差异性。

3.5 唐秦地区禽致病性E.coli生物膜与耐药性之间的关系

细菌的黏附是细菌生物被膜形成的关键过程，部分细菌性疾病与细菌被膜有关。生物膜的形成可以对外界抗菌药物有抵抗力，大肠杆菌生物膜形成能力与耐药性有关。宋学红等[26]对北京、上海、广东、河南分离的198株鸡肉源大肠杆菌进行生物膜形成能力测定，结果表明强生物膜分离株有95株，占比47.98%；弱生物膜分离株有93株，占比46.97%；不形成生物膜有10株，占比5.05%。其生物膜形成能力与耐药性相关性分析，显示没有显著性差异（P 值为 0.493，P＞0.05）。张召兴等[27]对河北地区分离出92株大肠杆菌进行生物膜能力进行测定，与14种抗生素的符合率在73.70%以上。本试验从河北地区秦皇岛市和唐山市分离的92株禽致病性E.coli中，共有82株能形成生物膜，占分离菌株的89.13%。其中，强形成膜能力菌株有46株，中形成膜能力菌株有24株，弱形成膜能力菌株有12株，不形成被膜菌株有10株，分别占分离菌株的50.00%、26.09%、13.04%和10.87%。其生物被膜形成能力与耐药性相关性分析结果显示，分离的92株蛋鸡致病性E.coli的生物被膜形成能力与13种抗生素耐药性的符合率在78.9%以上，其产生的耐药性与大肠杆菌的生物被膜形成能力有所相关。

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Detection and Analysis of Serotypes， Virulence Genes， Drug Resistance， and Biofilm of Pathogenic Escherichia coli in Laying Hens in the Tang and Qin Regions

YIN Heyu， YI Xueyan， GU Yuhua， KUANG Huali， ZHOU Runyu， LI Yunyu， LI Peiguo， JIA Qinghui

（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066604，China）

Abstract： To understand the prevalence of Escherichia coli in laying hens in the Tangqin region， this study collected 92 strains of Escherichia coli identified from the Tangqin region in 2023， and tested the serotypes， virulence genes， drug resistance， and biofilm formation ability of 92 pathogenic Escherichia coli strains isolated from some areas of Tangshan and Qinhuangdao in Hebei Province. The results showed that the isolated strains of Escherichia coli were divided into 11 serotypes. The dominant serotypes are O78 （62/69.57%）， O45 （30/32.61%）and O2 （20/21.74%）. The carrying status of 16 virulence genes was detected by testing the virulence genes of isolated strains， but no virulence genes such as iutB， Ler， and eaeA2 were detected. The carrier status of 25 antibiotic resistance genes was detected in the isolated strains， but KPC， CMY-2， Oxa-1， SHV， Tet （C）， Tet （G）， qnrA， qnrB， qnrC， qnrD， ermA， and mefA genes were not detected. Severe resistance to lincomycin， ampicillin， amoxicillin， compound sulfamethoxazole， and tetracycline， sensitive to ciprofloxacin and spectinomycin. Among the 92 strains of Escherichia coli， 46 strains （50%） had strong membrane forming ability， 24 strains （26.09%） had medium membrane forming ability， 12 strains （13.04%） had weak membrane forming ability， and 10 strains 10.87% did not form BF. The results of this experiment provide a scientific basis for the prevention and treatment of Escherichia coli disease in laying hens in the Qinhuangdao and Tangshan regions of Hebei Province.

Keywords： Laying hens; Escherichia coli; Serotypes; Virulence gene